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echochen1017新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
提質(zhì)粒酶切
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1、從BL21-pET28a-gene中提取質(zhì)粒，有的提不出來(lái)，然后對(duì)提出來(lái)的酶切，pET28a居然在一個(gè)小時(shí)左右被切碎（電泳無(wú)條帶，只有瀑布狀的東西）。 2、將目的基因與pET28a連接，轉(zhuǎn)化入BL21中，抗性篩選出菌落，培養(yǎng)，蛋白表達(dá)（量少，基本不表達(dá)），酶活檢測(cè)，對(duì)底物具有活性，且重復(fù)三次結(jié)果一致，呈現(xiàn)質(zhì)粒構(gòu)建成功的狀態(tài)，但是提質(zhì)粒后，卻沒(méi)有條帶，求大神解答！！ |
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gyesang
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
kx444555: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2013-06-05 12:00:01
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我覺(jué)得不適合從BL21菌株中提取質(zhì)粒，BL21是個(gè)表達(dá)菌株，不妨可以分析一下其基因型，基因型如下： BL21(DE3) F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]) DH5α F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK- mK+), λ– 通過(guò)將BL21(DE3)與DH5α比較，你會(huì)發(fā)現(xiàn)，BL21（DE3）中存在endA1和 recA1，這兩個(gè)基因中前者編碼核酸內(nèi)切酶，后者編碼重組酶，也就是說(shuō)質(zhì)粒轉(zhuǎn)進(jìn)BL21是不穩(wěn)定的即容易被降解和重組 所以你從BL21中提取質(zhì)粒，有的提不出來(lái)，對(duì)提出來(lái)的酶切，在一個(gè)小時(shí)左右被切碎（電泳無(wú)條帶，只有瀑布狀的東西）是很正常的 [ Last edited by gyesang on 2013-6-2 at 16:17 ] |
4樓2013-06-02 15:08:57
gyesang
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9樓2013-06-03 10:42:25
songzuowei
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2樓2013-06-02 14:41:54
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3樓2013-06-02 14:59:57
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5樓2013-06-02 15:15:57
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6樓2013-06-02 21:07:06
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echochen1017
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8樓2013-06-03 09:37:13
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