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carot金蟲 (正式寫手)
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[求助]
請教一個E.coli發(fā)酵前期乙酸積累的問題
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從大腸桿菌接種到罐里開始到補料前的一段時間，比生長速率一般都會達到0.4-0.5，到溶氧上去這段時間乙酸濃度很容易就達到2g/L以上。 想請教一下是應(yīng)該等菌體消耗一部分乙酸(即等乙酸濃度下來一點)再開始補料，還是溶氧一上升就立刻補呢，如果立刻補，貌似乙酸濃度就不能維持在比較低的水平了。 希望有經(jīng)驗的蟲子不吝賜教，謝謝！ |
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志子
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【答案】應(yīng)助回帖
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zhangxingc: 金幣+5, 很好的應(yīng)助呀 2013-06-08 16:26:49
carot: 金幣+1, 想問的是實際的操作經(jīng)驗，不需要理論性的東西，不過還是感謝參與。 2013-06-08 16:40:58
amisking: MicEPI+1, 很好的應(yīng)助。 2013-06-08 22:11:59
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乙酸是大腸桿菌發(fā)酵過程中的代謝副產(chǎn)物，在多大的濃度下產(chǎn)生抑制作用各種說法不一，一般認為在好氣性條件下，5～10g/L 的乙酸濃度就能對滯后期、最大比生長速率、菌體濃度以及最后蛋白收率等都產(chǎn)生可觀測到的抑制作用。當乙酸濃度大于10或20g/L 時，細胞將會停止生長，當培養(yǎng)液中乙酸濃度大于12g/L 后外源蛋白的表達完全被抑制。 降低乙酸產(chǎn)生量的措施： 1、通過控制比生長速率來減少乙酸的產(chǎn)生： 比生長速率越高，乙酸產(chǎn)生越多，當比生長速率超過某個值時，乙酸開始產(chǎn)生�？梢酝ㄟ^降低溫度，調(diào)節(jié)酸堿度，控制補料等方法來降低比生長速率。 2、透析培養(yǎng)： 在大腸桿菌的培養(yǎng)過程中可以用透析技術(shù)除去發(fā)酵液中的有害物質(zhì)，降低乙酸含量從而實現(xiàn)重組菌的高密度發(fā)酵和產(chǎn)物的表達。 3、控制葡萄糖的濃度： 葡萄糖是大腸桿菌發(fā)酵過程中重要的碳源之一，用其作碳源是要將其控制在一個較低的水平上，以減少乙酸的產(chǎn)生。 微生物學(xué)課本上提示的常用的控制方法主要有： 恒pH法：大腸桿菌會代謝葡萄等產(chǎn)生乙酸，使pH 值下降。因此可通過pH值的高低作為控制葡萄糖的指標，該法的缺點是pH 的變化不完全是由葡萄糖代謝的結(jié)果，容易造成補料體系出錯。 恒溶氧法：菌體代謝時會消耗氧，使溶氧下降，當葡萄糖濃度低到一定程度時菌體代謝下降，消耗氧能力下降，溶氧上升。因此，根據(jù)溶氧曲線補加葡萄糖，保持溶氧恒定，可以控制葡萄糖在一定的水平。 |
2樓2013-06-08 16:13:26
3樓2013-06-09 09:53:15
jiangronglu
鐵桿木蟲 (著名寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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carot(zhang8826857代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵一下。 2013-06-26 10:28:50
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carot(zhang8826857代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵一下。 2013-06-26 10:28:50
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菌生長的障礙是：①重組菌攜帶外源基因，加重代謝負擔，生長緩慢；②外源蛋白不能分泌到胞外，在菌體內(nèi)合 成后就會造成積累。高表達的外源蛋白尤其是高度疏水性蛋白對菌體有害，對細胞生長有抑制作用，甚至?xí)䦟?dǎo)致細 胞中毒或死亡, 因此工程菌的比生長速率往往遠小于宿主菌。 高表達的障礙是：①外源基因的不穩(wěn)定，造成表達的下降；②高生長速率與高表達之間的矛盾；③乙酸的產(chǎn)生；④ 蛋白的降解。 高密度培養(yǎng)的措施: 分批補料培養(yǎng)：以分批培養(yǎng)為基礎(chǔ)，吸取了連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)點，可消除高濃度底物對細胞生長的抑制作用，還可以 彌補低濃度底物限制細胞生長的缺陷，從而有效地控制了菌體的生長過程。因此，要實現(xiàn)重組大腸桿菌的高密度培 養(yǎng)，最常用和最有效的方法就是分批流加補料培養(yǎng)法。現(xiàn)在常用的是反饋補料培養(yǎng)。有幾種反饋控制 控制基質(zhì)濃度流加:用專門的電極維持基質(zhì)濃度（如葡萄糖、乙酸、氨等）。以葡萄糖為例，用葡萄糖電極檢測發(fā) 酵液中的葡萄糖含量，葡萄糖電極通過反饋系統(tǒng)與補糖單元相連。當葡萄糖濃度在設(shè)定值之上，糖閥關(guān)閉；當葡萄 糖濃度由于菌體消耗低于設(shè)定值時，糖閥開啟，葡萄糖以一定速率加入。這樣，發(fā)酵液中的葡萄糖濃度始終保持恒 定，可避免葡萄糖的抑制效應(yīng)，達到很高的細胞濃度。 恒pH流加：大腸桿菌在LB培養(yǎng)基上生長，pH會上升。這是由于菌體分解LB培養(yǎng)基中的胰蛋白胨，造成氨積 累的原因。因此用葡萄糖代替酸液進行恒pH流加。實驗通過pH反饋控制系統(tǒng)流加葡萄糖，使pH恒定，結(jié)果推遲 了比生長速率降低的時間，細胞密度是無流加的2倍。也可以以葡萄糖代替酸液，以氨水代替氫氧化鈉堿液，同時 流加氨水和葡萄糖。這種方法的缺點是葡萄糖濃度往往不易控制，容易產(chǎn)生乙酸，對某些工程菌不適宜。 恒溶氧流加:用復(fù)膜氧電極來控制補糖。當培養(yǎng)液的氧飽和百分數(shù)高于控制點，糖閥開啟，以一定速率補糖。加入 的糖被菌利用則需要更多的氧，從而降低溶氧濃度，引起讀數(shù)下降。當讀數(shù)下降到控制點以下，糖閥關(guān)閉，需氧就 會隨之減少，溶氧逐漸上升，從而達到供需平衡。Konstantinov等進一步發(fā)展了這種方法，用DO-state法間歇流加 葡萄糖，通過控制溶氧、攪拌轉(zhuǎn)速及糖流加速率，使乙酸維持在低濃度，從而獲得高密度和高表達。 控制比生長速率的葡萄糖流加:菌體的比生長速率與代謝產(chǎn)物的表達密切相關(guān)。比生長速率太大，超過某一值，易產(chǎn) 生乙酸，這一比生長速率值稱為菌體的乙酸產(chǎn)生臨界比生長速率。通過考察得出最優(yōu)比生長速率，控制溶氧、轉(zhuǎn)速、 補糖來控制比生長速率。 |
4樓2013-06-09 10:28:11
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