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carot金蟲 (正式寫手)
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[求助]
請(qǐng)教一個(gè)E.coli發(fā)酵前期乙酸積累的問題
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從大腸桿菌接種到罐里開始到補(bǔ)料前的一段時(shí)間，比生長(zhǎng)速率一般都會(huì)達(dá)到0.4-0.5，到溶氧上去這段時(shí)間乙酸濃度很容易就達(dá)到2g/L以上。 想請(qǐng)教一下是應(yīng)該等菌體消耗一部分乙酸(即等乙酸濃度下來一點(diǎn))再開始補(bǔ)料，還是溶氧一上升就立刻補(bǔ)呢，如果立刻補(bǔ)，貌似乙酸濃度就不能維持在比較低的水平了。 希望有經(jīng)驗(yàn)的蟲子不吝賜教，謝謝！ |
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鐵桿木蟲 (著名寫手)
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carot(zhang8826857代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)一下。 2013-06-26 10:28:50
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carot(zhang8826857代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)一下。 2013-06-26 10:28:50
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菌生長(zhǎng)的障礙是：①重組菌攜帶外源基因，加重代謝負(fù)擔(dān)，生長(zhǎng)緩慢；②外源蛋白不能分泌到胞外，在菌體內(nèi)合 成后就會(huì)造成積累。高表達(dá)的外源蛋白尤其是高度疏水性蛋白對(duì)菌體有害，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用，甚至?xí)䦟?dǎo)致細(xì) 胞中毒或死亡, 因此工程菌的比生長(zhǎng)速率往往遠(yuǎn)小于宿主菌。 高表達(dá)的障礙是：①外源基因的不穩(wěn)定，造成表達(dá)的下降；②高生長(zhǎng)速率與高表達(dá)之間的矛盾；③乙酸的產(chǎn)生；④ 蛋白的降解。 高密度培養(yǎng)的措施: 分批補(bǔ)料培養(yǎng)：以分批培養(yǎng)為基礎(chǔ)，吸取了連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，可消除高濃度底物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，還可以 彌補(bǔ)低濃度底物限制細(xì)胞生長(zhǎng)的缺陷，從而有效地控制了菌體的生長(zhǎng)過程。因此，要實(shí)現(xiàn)重組大腸桿菌的高密度培 養(yǎng)，最常用和最有效的方法就是分批流加補(bǔ)料培養(yǎng)法�，F(xiàn)在常用的是反饋補(bǔ)料培養(yǎng)。有幾種反饋控制 控制基質(zhì)濃度流加:用專門的電極維持基質(zhì)濃度（如葡萄糖、乙酸、氨等）。以葡萄糖為例，用葡萄糖電極檢測(cè)發(fā) 酵液中的葡萄糖含量，葡萄糖電極通過反饋系統(tǒng)與補(bǔ)糖單元相連。當(dāng)葡萄糖濃度在設(shè)定值之上，糖閥關(guān)閉；當(dāng)葡萄 糖濃度由于菌體消耗低于設(shè)定值時(shí)，糖閥開啟，葡萄糖以一定速率加入。這樣，發(fā)酵液中的葡萄糖濃度始終保持恒 定，可避免葡萄糖的抑制效應(yīng)，達(dá)到很高的細(xì)胞濃度。 恒pH流加：大腸桿菌在LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，pH會(huì)上升。這是由于菌體分解LB培養(yǎng)基中的胰蛋白胨，造成氨積 累的原因。因此用葡萄糖代替酸液進(jìn)行恒pH流加。實(shí)驗(yàn)通過pH反饋控制系統(tǒng)流加葡萄糖，使pH恒定，結(jié)果推遲 了比生長(zhǎng)速率降低的時(shí)間，細(xì)胞密度是無流加的2倍。也可以以葡萄糖代替酸液，以氨水代替氫氧化鈉堿液，同時(shí) 流加氨水和葡萄糖。這種方法的缺點(diǎn)是葡萄糖濃度往往不易控制，容易產(chǎn)生乙酸，對(duì)某些工程菌不適宜。 恒溶氧流加:用復(fù)膜氧電極來控制補(bǔ)糖。當(dāng)培養(yǎng)液的氧飽和百分?jǐn)?shù)高于控制點(diǎn)，糖閥開啟，以一定速率補(bǔ)糖。加入 的糖被菌利用則需要更多的氧，從而降低溶氧濃度，引起讀數(shù)下降。當(dāng)讀數(shù)下降到控制點(diǎn)以下，糖閥關(guān)閉，需氧就 會(huì)隨之減少，溶氧逐漸上升，從而達(dá)到供需平衡。Konstantinov等進(jìn)一步發(fā)展了這種方法，用DO-state法間歇流加 葡萄糖，通過控制溶氧、攪拌轉(zhuǎn)速及糖流加速率，使乙酸維持在低濃度，從而獲得高密度和高表達(dá)。 控制比生長(zhǎng)速率的葡萄糖流加:菌體的比生長(zhǎng)速率與代謝產(chǎn)物的表達(dá)密切相關(guān)。比生長(zhǎng)速率太大，超過某一值，易產(chǎn) 生乙酸，這一比生長(zhǎng)速率值稱為菌體的乙酸產(chǎn)生臨界比生長(zhǎng)速率。通過考察得出最優(yōu)比生長(zhǎng)速率，控制溶氧、轉(zhuǎn)速、 補(bǔ)糖來控制比生長(zhǎng)速率。 |
4樓2013-06-09 10:28:11
志子
至尊木蟲 (文壇精英)
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【答案】應(yīng)助回帖
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zhangxingc: 金幣+5, 很好的應(yīng)助呀 2013-06-08 16:26:49
carot: 金幣+1, 想問的是實(shí)際的操作經(jīng)驗(yàn)，不需要理論性的東西，不過還是感謝參與。 2013-06-08 16:40:58
amisking: MicEPI+1, 很好的應(yīng)助。 2013-06-08 22:11:59
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carot: 金幣+1, 想問的是實(shí)際的操作經(jīng)驗(yàn)，不需要理論性的東西，不過還是感謝參與。 2013-06-08 16:40:58
amisking: MicEPI+1, 很好的應(yīng)助。 2013-06-08 22:11:59
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乙酸是大腸桿菌發(fā)酵過程中的代謝副產(chǎn)物，在多大的濃度下產(chǎn)生抑制作用各種說法不一，一般認(rèn)為在好氣性條件下，5～10g/L 的乙酸濃度就能對(duì)滯后期、最大比生長(zhǎng)速率、菌體濃度以及最后蛋白收率等都產(chǎn)生可觀測(cè)到的抑制作用。當(dāng)乙酸濃度大于10或20g/L 時(shí)，細(xì)胞將會(huì)停止生長(zhǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液中乙酸濃度大于12g/L 后外源蛋白的表達(dá)完全被抑制。 降低乙酸產(chǎn)生量的措施： 1、通過控制比生長(zhǎng)速率來減少乙酸的產(chǎn)生： 比生長(zhǎng)速率越高，乙酸產(chǎn)生越多，當(dāng)比生長(zhǎng)速率超過某個(gè)值時(shí)，乙酸開始產(chǎn)生�？梢酝ㄟ^降低溫度，調(diào)節(jié)酸堿度，控制補(bǔ)料等方法來降低比生長(zhǎng)速率。 2、透析培養(yǎng)： 在大腸桿菌的培養(yǎng)過程中可以用透析技術(shù)除去發(fā)酵液中的有害物質(zhì)，降低乙酸含量從而實(shí)現(xiàn)重組菌的高密度發(fā)酵和產(chǎn)物的表達(dá)。 3、控制葡萄糖的濃度： 葡萄糖是大腸桿菌發(fā)酵過程中重要的碳源之一，用其作碳源是要將其控制在一個(gè)較低的水平上，以減少乙酸的產(chǎn)生。 微生物學(xué)課本上提示的常用的控制方法主要有： 恒pH法：大腸桿菌會(huì)代謝葡萄等產(chǎn)生乙酸，使pH 值下降。因此可通過pH值的高低作為控制葡萄糖的指標(biāo)，該法的缺點(diǎn)是pH 的變化不完全是由葡萄糖代謝的結(jié)果，容易造成補(bǔ)料體系出錯(cuò)。 恒溶氧法：菌體代謝時(shí)會(huì)消耗氧，使溶氧下降，當(dāng)葡萄糖濃度低到一定程度時(shí)菌體代謝下降，消耗氧能力下降，溶氧上升。因此，根據(jù)溶氧曲線補(bǔ)加葡萄糖，保持溶氧恒定，可以控制葡萄糖在一定的水平。 |
2樓2013-06-08 16:13:26
【答案】應(yīng)助回帖
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carot: 金幣+10, ★★★很有幫助, 非常感謝幫忙！ 2013-06-13 10:54:04
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
carot: 金幣+10, ★★★很有幫助, 非常感謝幫忙！ 2013-06-13 10:54:04
| 這位仁兄，我們實(shí)驗(yàn)室主要就是做大腸桿菌高密度發(fā)酵的，對(duì)于你說的這種情況，我們這邊一般是等到碳源消耗完，再等到有機(jī)酸消耗完就開始補(bǔ)料，也就是說在這個(gè)過程你會(huì)發(fā)現(xiàn)DO出現(xiàn)兩次升高，進(jìn)入補(bǔ)料階段后，乙酸的積累量就少了，但同時(shí)要注意當(dāng)你進(jìn)入誘導(dǎo)階段后乙酸含量還是會(huì)大量積累，此時(shí)我建議你通入富氧空氣！ |
3樓2013-06-09 09:53:15
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