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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » PCR的問題
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[求助]
PCR的問題
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| 做的PCR也長出克隆，但是測序時出現(xiàn)這樣的問題：把我的設計的引物段查找出現(xiàn)是一段正確的，但是比如我的引物設計28個堿基，如果輸入20個左右甚至27個時，都會出現(xiàn)兩段甚至四段。請問這是什么原因呢 |
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 核酸生物學實驗經(jīng)驗 |
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【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★ ★
1949stone: MolEPI+1, 學習下 2013-06-25 12:24:01
crjtina: 金幣+5, ★★★很有幫助, 非常感謝，我試圖仔細查找各方面原因分析。 2013-06-25 15:07:01
1949stone: MolEPI+1, 學習下 2013-06-25 12:24:01
crjtina: 金幣+5, ★★★很有幫助, 非常感謝，我試圖仔細查找各方面原因分析。 2013-06-25 15:07:01
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請樓主另外考慮： 1.可能存在靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：（1）整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。（2）是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性�？苫ハ嗥唇�，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。（3）使用微量移液器時最好用移液器的塑料接頭末端處與微量移液器吸桿之間有過濾膜的，如果沒有則在塑料接頭末端處塞上一小團消毒棉花，以便在吸入液體時阻止塑料接頭中的液體由于負壓形成氣溶膠進入微量移液器吸桿，這是更換了接頭仍然會有污染。 2.引物與靶序列不完全互補、 或引物聚合形成二聚體需要重新設計引物。 3.Mg2+ 離子濃度過高，從1.0mmol/L分梯度上調，不能超過10.0mmol/L，每次上升0.05mmol/L。 4.退火溫度過低。 5.PCR循環(huán)次數(shù)過多有關。 6.在PCR反應體系中加入0.01%的白明膠或BSA或Triton X-100,以便增加擴增的專一性。 |
6樓2013-06-25 12:04:47
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