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[求助]
PCR的問(wèn)題
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| 做的PCR也長(zhǎng)出克隆，但是測(cè)序時(shí)出現(xiàn)這樣的問(wèn)題：把我的設(shè)計(jì)的引物段查找出現(xiàn)是一段正確的，但是比如我的引物設(shè)計(jì)28個(gè)堿基，如果輸入20個(gè)左右甚至27個(gè)時(shí)，都會(huì)出現(xiàn)兩段甚至四段。請(qǐng)問(wèn)這是什么原因呢 |
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 核酸生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) |
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2樓2013-06-24 18:01:30
凌波麗
專家顧問(wèn) (知名作家)
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3樓2013-06-24 21:32:55
4樓2013-06-25 08:23:32
5樓2013-06-25 08:26:22
凌波麗
專家顧問(wèn) (知名作家)
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專家經(jīng)驗(yàn): +218 - MolEPI: 44
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
1949stone: MolEPI+1, 學(xué)習(xí)下 2013-06-25 12:24:01
crjtina: 金幣+5, ★★★很有幫助, 非常感謝，我試圖仔細(xì)查找各方面原因分析。 2013-06-25 15:07:01
1949stone: MolEPI+1, 學(xué)習(xí)下 2013-06-25 12:24:01
crjtina: 金幣+5, ★★★很有幫助, 非常感謝，我試圖仔細(xì)查找各方面原因分析。 2013-06-25 15:07:01
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請(qǐng)樓主另外考慮： 1.可能存在靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：（1）整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。（2）是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性�？苫ハ嗥唇樱c引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來(lái)減輕或消除。（3）使用微量移液器時(shí)最好用移液器的塑料接頭末端處與微量移液器吸桿之間有過(guò)濾膜的，如果沒有則在塑料接頭末端處塞上一小團(tuán)消毒棉花，以便在吸入液體時(shí)阻止塑料接頭中的液體由于負(fù)壓形成氣溶膠進(jìn)入微量移液器吸桿，這是更換了接頭仍然會(huì)有污染。 2.引物與靶序列不完全互補(bǔ)、 或引物聚合形成二聚體需要重新設(shè)計(jì)引物。 3.Mg2+ 離子濃度過(guò)高，從1.0mmol/L分梯度上調(diào)，不能超過(guò)10.0mmol/L，每次上升0.05mmol/L。 4.退火溫度過(guò)低。 5.PCR循環(huán)次數(shù)過(guò)多有關(guān)。 6.在PCR反應(yīng)體系中加入0.01%的白明膠或BSA或Triton X-100,以便增加擴(kuò)增的專一性。 |
6樓2013-06-25 12:04:47
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