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凝霜楓葉

銀蟲(chóng) (小有名氣)

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[求助] 藍(lán)藻DNA提取，液氮研磨

蟲(chóng)友們，請(qǐng)問(wèn)有木有用液氮研磨提取藍(lán)藻DNA的呀？我之前沒(méi)用過(guò)液氮研磨，也沒(méi)見(jiàn)過(guò)別人怎么用液氮研磨的，周圍也沒(méi)有做植物的，就想跟大家請(qǐng)教一下用液氮研磨的注意事項(xiàng)，1：是不是一加進(jìn)液氮就開(kāi)始研磨（我發(fā)現(xiàn)研磨的時(shí)候會(huì)濺出來(lái)液氮）？研磨的時(shí)候用多大的力度？是沿著研缽的外圍研磨嗎？2：研磨之后不知道為什么我的樣品不是干粉狀，反而有些潮濕，不太好轉(zhuǎn)；，3：還有就是研磨之后是直接把裂解液加到研缽中還是轉(zhuǎn)移之后再加？只研磨了兩次，很多經(jīng)驗(yàn)還木有，望各位蟲(chóng)友尤其是同樣提藍(lán)藻DNA的不吝賜教呀，因?yàn)闃悠繁容^少，所以不敢浪費(fèi)，急急急……

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【求助/交流】藍(lán)藻細(xì)胞破碎？已經(jīng)有6人回復(fù)

1樓 2013-06-27 16:29:14

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引用回帖:

8樓: Originally posted by 凝霜楓葉 at 2013-06-28 20:47:32
我的藻一般是絲狀的，不知道行不行...

絲狀藻比單細(xì)胞藻更好破。藍(lán)藻的細(xì)胞比較小，液氮研磨的效果不是很好。

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凝霜楓葉

10樓2013-06-29 08:26:54

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15樓: Originally posted by 凝霜楓葉 at 2013-07-02 08:51:33
那你實(shí)驗(yàn)室的protocol和酶學(xué)老方法都方便告訴我嗎？真心感謝呀，

，我的郵箱jiaoshujing1988@163.com，方便的話請(qǐng)發(fā)給我吧，

...

我用的方法：
1. Scratch a loop of cells from a plate and resuspend cells into 0.5 ml of isolation buffer (50 mM Tris-HCl pH 8.5, 5 mM EDTA, 50 mM NaCl)
2. Add 10 μg DNase-free RNase
3. Add same volume of phenol, heat at 65°C for 5-10 min, mix 2-3 times in between
4. Extract 2 x with phenol:chloroform (1:1) and once with chloroform:amyalcohol (24:1), invert tubes gently by now and then for 5 min
5. Add 1 µg RNase, RT for 30 min
6. Add 1/10V 3M sodium acetate pH5.2, and 2V cold ethanol, store at -20 °C 2h or over night
7. Collect DNA at 14 000 g for 15 min, wash the pellet with 70 % ethanol.
8. Dissolve pellet into 100 µl of TE/water/ 5 mM Tris-HCl pH 8.
所得DNA的濃度大致為幾百ng/μl，取0.5-1μl為模板做PCR即可。

酶學(xué)方法167卷的方法見(jiàn)附件：

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附件 1 : 82[78]DNAtransformation.pdf

2013-07-02 10:01:58, 580.58 K

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凝霜楓葉

16樓2013-07-02 10:02:25

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★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
凝霜楓葉: 金幣+5, ★有幫助 2013-06-28 09:43:28

你的DNA做什么用？我一直用酚提的，效率不錯(cuò)。也有人按酶學(xué)方法上的老法子提。沒(méi)用過(guò)液氮研磨。

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2樓2013-06-28 00:09:12

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我不是做植物的，不過(guò)幫同學(xué)做過(guò)植物液氮研磨的，加入液氮后就研磨

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偶爾幽生活一默你會(huì)覺(jué)得很爽，但生活幽你一默就慘了……

3樓2013-06-28 09:18:58

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3樓: Originally posted by sinai at 2013-06-28 09:18:58
我不是做植物的，不過(guò)幫同學(xué)做過(guò)植物液氮研磨的，加入液氮后就研磨

請(qǐng)問(wèn)研磨的時(shí)候液氮會(huì)濺出來(lái)嗎？

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4樓2013-06-28 09:42:41

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2樓: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-28 00:09:12
你的DNA做什么用？我一直用酚提的，效率不錯(cuò)。也有人按酶學(xué)方法上的老法子提。沒(méi)用過(guò)液氮研磨。

我就是為了后續(xù)的PCR，要求不高，只要是純基因組DNA就可以的，我用的試劑盒提取的

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5樓2013-06-28 09:44:35

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★ ★ ★ ★
凝霜楓葉: 金幣+5, ★有幫助 2013-06-28 20:47:03

引用回帖:

5樓: Originally posted by 凝霜楓葉 at 2013-06-28 09:44:35
我就是為了后續(xù)的PCR，要求不高，只要是純基因組DNA就可以的，我用的試劑盒提取的...

做PCR的基因組DNA不用這么麻煩，直接用緩沖液重懸細(xì)胞，用酚破藻就可以了。便宜而且破碎效果很好。

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6樓2013-06-28 13:16:01

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★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
凝霜楓葉: 金幣+5, ★有幫助 2013-06-28 20:47:45

那倒是沒(méi)有，使勁磨就好了

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7樓2013-06-28 20:01:19

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6樓: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-28 13:16:01
做PCR的基因組DNA不用這么麻煩，直接用緩沖液重懸細(xì)胞，用酚破藻就可以了。便宜而且破碎效果很好。...

我的藻一般是絲狀的，不知道行不行

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8樓2013-06-28 20:47:32

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7樓: Originally posted by sinai at 2013-06-28 20:01:19
那倒是沒(méi)有，使勁磨就好了

那看來(lái)還是我不會(huì)磨呀

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9樓2013-06-28 20:48:01

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