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藍(lán)藻DNA提取，液氮研磨
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| 蟲(chóng)友們，請(qǐng)問(wèn)有木有用液氮研磨提取藍(lán)藻DNA的呀？我之前沒(méi)用過(guò)液氮研磨，也沒(méi)見(jiàn)過(guò)別人怎么用液氮研磨的，周圍也沒(méi)有做植物的，就想跟大家請(qǐng)教一下用液氮研磨的注意事項(xiàng)，1：是不是一加進(jìn)液氮就開(kāi)始研磨（我發(fā)現(xiàn)研磨的時(shí)候會(huì)濺出來(lái)液氮）？研磨的時(shí)候用多大的力度？是沿著研缽的外圍研磨嗎？2：研磨之后不知道為什么我的樣品不是干粉狀，反而有些潮濕，不太好轉(zhuǎn)；，3：還有就是研磨之后是直接把裂解液加到研缽中還是轉(zhuǎn)移之后再加？只研磨了兩次，很多經(jīng)驗(yàn)還木有，望各位蟲(chóng)友尤其是同樣提藍(lán)藻DNA的不吝賜教呀，因?yàn)闃悠繁容^少，所以不敢浪費(fèi)，急急急…… |
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cicelyzh
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凝霜楓葉10樓2013-06-29 08:26:54
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我用的方法： 1. Scratch a loop of cells from a plate and resuspend cells into 0.5 ml of isolation buffer (50 mM Tris-HCl pH 8.5, 5 mM EDTA, 50 mM NaCl) 2. Add 10 μg DNase-free RNase 3. Add same volume of phenol, heat at 65°C for 5-10 min, mix 2-3 times in between 4. Extract 2 x with phenol:chloroform (1:1) and once with chloroform:amyalcohol (24:1), invert tubes gently by now and then for 5 min 5. Add 1 µg RNase, RT for 30 min 6. Add 1/10V 3M sodium acetate pH5.2, and 2V cold ethanol, store at -20 °C 2h or over night 7. Collect DNA at 14 000 g for 15 min, wash the pellet with 70 % ethanol. 8. Dissolve pellet into 100 µl of TE/water/ 5 mM Tris-HCl pH 8. 所得DNA的濃度大致為幾百ng/μl，取0.5-1μl為模板做PCR即可。 酶學(xué)方法167卷的方法見(jiàn)附件： |
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2013-07-02 10:01:58, 580.58 K
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16樓2013-07-02 10:02:25
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