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小李愛學(xué)習(xí)銀蟲 (正式寫手)
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[求助]
芒果蔗糖轉(zhuǎn)化酶的純化遇到了問題 求高人指點(diǎn)
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我在純化芒果中的蔗糖轉(zhuǎn)化酶， 1、首先用50mM的Tris-Hcl pH7.1的緩沖液（緩沖液中加了EDTA-Na2,苯甲脒、DTT、PMSF等一些列保護(hù)劑）提取的，硫酸銨沉淀后用同樣的緩沖液透析。 2、然后過DEAE-Sepharose柱，用含有0~0.5M的NaCl緩沖液梯度洗脫，流速0.6ml/min，高酶活組分在0.3~0.35M的NaCl濃度被洗脫下來。 3、然后濃縮有活性組分過Sephacryl-300 HR柱，柱子是1.5cm*100cm規(guī)格的，洗脫用的緩沖液是含有0.1M NaCl的 50mM Tris-HCl緩沖液，流速為0.3ml/min，然后收集活性組分濃縮電泳分析發(fā)現(xiàn)與過Sephacryl-300 HR柱之前沒有什么區(qū)別，只是有的條帶更濃了，雜蛋白還是很多。注：過柱之前我分別用截留分子量50 K和100 K的超濾離心管進(jìn)行了試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)50k的膜能將酶完全截留住，100 K的的膜不能完全將酶截留，如果這樣的話 那酶的分子量應(yīng)該在150k~300K之間，Sephacryl-300 HR適合分離10—1500K的蛋白，因此選擇了Sephacryl-300 HR。 4、下面是電泳圖 從左到右標(biāo)號(hào)為1的是過DEAE-Sepharose之前的，標(biāo)2的為過DEAE-Sepharose之后的活性組分；標(biāo)3的是過Sephacryl-300 HR的活性組分。2和3 是在收集到了活性組分進(jìn)行濃縮后進(jìn)行電泳分析的。 大家?guī)椭纯?分析下是什么原因?qū)е路蛛x效果不好的? 如果這一步不能實(shí)現(xiàn)純化，應(yīng)該繼續(xù)采取什么手段呢？個(gè)人覺得可能是由于： 1、過Sephacryl-300時(shí)流速過快 2、過Sephacryl-300時(shí)緩沖液體系或pH 不合適 3、Sephacryl-300這種填料不適合這種酶的分離，應(yīng)該換哪種填料呢？ 電泳3.png [ Last edited by 小李愛學(xué)習(xí) on 2013-6-27 at 22:14 ] |
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 蛋白質(zhì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) |
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【答案】應(yīng)助回帖
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蛋白質(zhì)純化——非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后回收蛋白質(zhì)的簡(jiǎn)單方法 http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=4054503 半年前我拿到EPI的那些蛋白質(zhì)純化的帖子我找不到了，因?yàn)辄c(diǎn)擊EPI記錄的時(shí)候論壇不把它們顯示出來，剩下我發(fā)的一張主題帖倒是無(wú)論過多久都還顯示出來，就貼上來算了，因?yàn)槲业闹庇X是依照現(xiàn)在的情況，割膠可能是有必要的，至于原因，分析起來打字要花大半小時(shí)，很麻煩。 一方面是近段時(shí)間忙得焦頭爛額，另一方面是不想重復(fù)拿EPI，但是看這個(gè)樓主如果想純化好，找找資料是很有必要的，不要一急就亂了陣腳，反而更不好解決問題。不過不知道3個(gè)月過去了，大概這個(gè)酶已經(jīng)達(dá)到電泳純了吧？ |
16樓2013-10-02 01:44:31
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