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小李?lèi)?ài)學(xué)習(xí)銀蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
芒果蔗糖轉(zhuǎn)化酶的純化遇到了問(wèn)題 求高人指點(diǎn)
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我在純化芒果中的蔗糖轉(zhuǎn)化酶， 1、首先用50mM的Tris-Hcl pH7.1的緩沖液（緩沖液中加了EDTA-Na2,苯甲脒、DTT、PMSF等一些列保護(hù)劑）提取的，硫酸銨沉淀后用同樣的緩沖液透析。 2、然后過(guò)DEAE-Sepharose柱，用含有0~0.5M的NaCl緩沖液梯度洗脫，流速0.6ml/min，高酶活組分在0.3~0.35M的NaCl濃度被洗脫下來(lái)。 3、然后濃縮有活性組分過(guò)Sephacryl-300 HR柱，柱子是1.5cm*100cm規(guī)格的，洗脫用的緩沖液是含有0.1M NaCl的 50mM Tris-HCl緩沖液，流速為0.3ml/min，然后收集活性組分濃縮電泳分析發(fā)現(xiàn)與過(guò)Sephacryl-300 HR柱之前沒(méi)有什么區(qū)別，只是有的條帶更濃了，雜蛋白還是很多。注：過(guò)柱之前我分別用截留分子量50 K和100 K的超濾離心管進(jìn)行了試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)50k的膜能將酶完全截留住，100 K的的膜不能完全將酶截留，如果這樣的話(huà) 那酶的分子量應(yīng)該在150k~300K之間，Sephacryl-300 HR適合分離10—1500K的蛋白，因此選擇了Sephacryl-300 HR。 4、下面是電泳圖 從左到右標(biāo)號(hào)為1的是過(guò)DEAE-Sepharose之前的，標(biāo)2的為過(guò)DEAE-Sepharose之后的活性組分；標(biāo)3的是過(guò)Sephacryl-300 HR的活性組分。2和3 是在收集到了活性組分進(jìn)行濃縮后進(jìn)行電泳分析的。 大家?guī)椭纯?分析下是什么原因?qū)е路蛛x效果不好的? 如果這一步不能實(shí)現(xiàn)純化，應(yīng)該繼續(xù)采取什么手段呢？個(gè)人覺(jué)得可能是由于： 1、過(guò)Sephacryl-300時(shí)流速過(guò)快 2、過(guò)Sephacryl-300時(shí)緩沖液體系或pH 不合適 3、Sephacryl-300這種填料不適合這種酶的分離，應(yīng)該換哪種填料呢？ 電泳3.png [ Last edited by 小李?lèi)?ài)學(xué)習(xí) on 2013-6-27 at 22:14 ] |
回復(fù)此樓» 收錄本帖的淘帖專(zhuān)輯推薦
 蛋白質(zhì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) |
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gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖應(yīng)助！ 2013-07-05 14:58:25
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| 樓主到這里找找線(xiàn)索吧。http://www.brenda-enzymes.org/php/result_flat.php4?ecno=3.2.1.26 ，http://www.doc88.com/p-2932992069897.html，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucl ... amp;RID=WX6HFY9X01R葡萄中性蔗糖酶和其他好幾種植物的約673個(gè)氨基酸，分子量約76kD,如果是二聚體，則有150kD了。至于超濾膜，截留孔徑是大約數(shù)的。 |
8樓2013-06-29 16:44:55
凌波麗
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小李?lèi)?ài)學(xué)習(xí): 金幣+100, ★★★很有幫助 2013-06-28 09:24:43
1949stone: 一次收這么多金幣 被系統(tǒng)懷疑金幣轉(zhuǎn)移了啊 ！ 2013-06-28 09:34:36
1949stone: 記得繼續(xù)會(huì)人家的問(wèn)題啊 嘿嘿 2013-06-28 09:35:11
小丹木木: 金幣-49, 應(yīng)助指數(shù)+1, 呵呵，樓主想要回多給的BB,所以把多給的扣回去了啊 2013-06-28 10:08:35
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小李?lèi)?ài)學(xué)習(xí): 金幣+100, ★★★很有幫助 2013-06-28 09:24:43
1949stone: 一次收這么多金幣 被系統(tǒng)懷疑金幣轉(zhuǎn)移了啊 ！ 2013-06-28 09:34:36
1949stone: 記得繼續(xù)會(huì)人家的問(wèn)題啊 嘿嘿 2013-06-28 09:35:11
小丹木木: 金幣-49, 應(yīng)助指數(shù)+1, 呵呵，樓主想要回多給的BB,所以把多給的扣回去了啊 2013-06-28 10:08:35
| 今天太晚了，我改日回答你，提示兩點(diǎn)：1.實(shí)在不行用目的蛋白質(zhì)送到生物技術(shù)公司制備出單克隆抗體（約3個(gè)月時(shí)間)，然后親和層析，制備單抗時(shí)你先做別的實(shí)驗(yàn)；2.到文獻(xiàn)中搜索一下同源蛋白質(zhì)的別人的提純方法。 |
2樓2013-06-28 02:46:46
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3樓2013-06-28 09:24:24
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4樓2013-06-28 10:20:36
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5樓2013-06-28 10:51:30
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6樓2013-06-28 12:32:16
小丹木木: 是一次性給太多金幣，系統(tǒng)會(huì)詢(xún)問(wèn)是否為轉(zhuǎn)移金幣，所以才會(huì)有上面的操作了，不是的話(huà)也不用擔(dān)心的，我們會(huì)檢查的 2013-06-28 14:45:29
| 看了版主的話(huà)，借個(gè)地方說(shuō)兩句，原來(lái)獎(jiǎng)勵(lì)金幣多也會(huì)被懷疑。我自己也會(huì)出比較多金幣問(wèn)問(wèn)題，然后自己也愛(ài)回答懸賞金幣多的問(wèn)題，沒(méi)辦法，缺金幣，但自己的問(wèn)題經(jīng)常沒(méi)得到想要的答案！以前在別的論壇也會(huì)這樣，久了就覺(jué)得光付出，沒(méi)得到幫助，就少上去了。小木蟲(chóng)還好，比自己水平高的人很多，還是可以學(xué)到東西，或者知道哪些地方可能會(huì)出問(wèn)題。 |
7樓2013-06-28 13:02:22
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9樓2013-06-29 21:43:40
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10樓2013-07-05 11:01:01
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