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芒果蔗糖轉(zhuǎn)化酶的純化遇到了問題 求高人指點
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我在純化芒果中的蔗糖轉(zhuǎn)化酶， 1、首先用50mM的Tris-Hcl pH7.1的緩沖液（緩沖液中加了EDTA-Na2,苯甲脒、DTT、PMSF等一些列保護劑）提取的，硫酸銨沉淀后用同樣的緩沖液透析。 2、然后過DEAE-Sepharose柱，用含有0~0.5M的NaCl緩沖液梯度洗脫，流速0.6ml/min，高酶活組分在0.3~0.35M的NaCl濃度被洗脫下來。 3、然后濃縮有活性組分過Sephacryl-300 HR柱，柱子是1.5cm*100cm規(guī)格的，洗脫用的緩沖液是含有0.1M NaCl的 50mM Tris-HCl緩沖液，流速為0.3ml/min，然后收集活性組分濃縮電泳分析發(fā)現(xiàn)與過Sephacryl-300 HR柱之前沒有什么區(qū)別，只是有的條帶更濃了，雜蛋白還是很多。注：過柱之前我分別用截留分子量50 K和100 K的超濾離心管進行了試驗，發(fā)現(xiàn)50k的膜能將酶完全截留住，100 K的的膜不能完全將酶截留，如果這樣的話 那酶的分子量應該在150k~300K之間，Sephacryl-300 HR適合分離10—1500K的蛋白，因此選擇了Sephacryl-300 HR。 4、下面是電泳圖 從左到右標號為1的是過DEAE-Sepharose之前的，標2的為過DEAE-Sepharose之后的活性組分；標3的是過Sephacryl-300 HR的活性組分。2和3 是在收集到了活性組分進行濃縮后進行電泳分析的。 大家?guī)椭纯?分析下是什么原因?qū)е路蛛x效果不好的? 如果這一步不能實現(xiàn)純化，應該繼續(xù)采取什么手段呢？個人覺得可能是由于： 1、過Sephacryl-300時流速過快 2、過Sephacryl-300時緩沖液體系或pH 不合適 3、Sephacryl-300這種填料不適合這種酶的分離，應該換哪種填料呢？ 電泳3.png [ Last edited by 小李愛學習 on 2013-6-27 at 22:14 ] |
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 蛋白質(zhì)生物學實驗經(jīng)驗 |
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gyesang: 金幣+2, 鼓勵回帖應助！ 2013-07-05 14:58:25
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| 樓主到這里找找線索吧。http://www.brenda-enzymes.org/php/result_flat.php4?ecno=3.2.1.26 ，http://www.doc88.com/p-2932992069897.html，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucl ... amp;RID=WX6HFY9X01R葡萄中性蔗糖酶和其他好幾種植物的約673個氨基酸，分子量約76kD,如果是二聚體，則有150kD了。至于超濾膜，截留孔徑是大約數(shù)的。 |
8樓2013-06-29 16:44:55
凌波麗
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小李愛學習: 金幣+100, ★★★很有幫助 2013-06-28 09:24:43
1949stone: 一次收這么多金幣 被系統(tǒng)懷疑金幣轉(zhuǎn)移了啊 ！ 2013-06-28 09:34:36
1949stone: 記得繼續(xù)會人家的問題啊 嘿嘿 2013-06-28 09:35:11
小丹木木: 金幣-49, 應助指數(shù)+1, 呵呵，樓主想要回多給的BB,所以把多給的扣回去了啊 2013-06-28 10:08:35
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| 今天太晚了，我改日回答你，提示兩點：1.實在不行用目的蛋白質(zhì)送到生物技術(shù)公司制備出單克隆抗體（約3個月時間)，然后親和層析，制備單抗時你先做別的實驗；2.到文獻中搜索一下同源蛋白質(zhì)的別人的提純方法。 |
2樓2013-06-28 02:46:46
3樓2013-06-28 09:24:24
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