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[求助]
鏈霉菌 接合轉(zhuǎn)移500金幣求助
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我做鏈霉菌的接合轉(zhuǎn)移已經(jīng)有將近2年時間，方法是鏈霉菌遺傳操作手冊上的，并閱讀文獻(xiàn)進(jìn)行改進(jìn)。我?guī)缀踝x遍了所有的關(guān)于這方面的文獻(xiàn)，做了無數(shù)次嘗試及實驗條件優(yōu)化，目前為止從未出現(xiàn)任何接合子，從未成功。 我在論壇里面也看了很懂做這方面工作的帖子，每次都在做不同的嘗試，依然沒有成功。 希望有經(jīng)驗的同學(xué)給以指導(dǎo)。一旦成功，愿意奉送高額金幣。 |
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2樓2013-07-13 18:01:32
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【答案】應(yīng)助回帖
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你用的質(zhì)粒是哪種？接合轉(zhuǎn)移這種方法有效克服宿主對外源DNA的限制性修飾。不同鏈霉菌的最優(yōu)條件不同，我可以把我之前優(yōu)化的條件給你做參考。 受體：孢子熱激后預(yù)萌發(fā) 取適量孢子懸液，直接50°C水浴熱激10min，待冷卻至室溫后加入等體積的2×孢子預(yù)萌發(fā)培養(yǎng)基，28°C，180r/min搖床培養(yǎng)2-3h，離心收集孢子，并重新懸浮于適量的TES緩沖液中，待用。 供體：含目的質(zhì)粒的ET12567（pUZ8002）過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到含有相應(yīng)抗生素的LB中，37°C，180r/min培養(yǎng)至濃度為OD600=0.4-0.6時，收集菌體。用等體積的新鮮LB洗滌菌體兩次（洗去抗生素），最后用0.1倍體積的LB懸浮備用。 接合轉(zhuǎn)移：分別取100μL含目的質(zhì)粒的ET12567（pUZ8002）和預(yù)萌發(fā)的孢子于eppendorf管中混勻靜置2min，然后涂布于MS培養(yǎng)基上，28°C倒置培養(yǎng)。一段時間后用1mL含有濃度為50μg/mL的萘啶酮酸和相應(yīng)濃度抗生素的水溶液均勻覆蓋。3-5天后可觀察有無轉(zhuǎn)化子長出。 遺傳轉(zhuǎn)化是菌種改造的第一步，祝樓主早點做通。  |
13樓2013-07-15 20:27:08
kingsoo
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
藍(lán)月望寧: 金幣+5, ★有幫助, 謝謝，這個已經(jīng)注意了。不知道受體菌有什么要求？ 2013-07-15 09:22:46
laozuzunzhe: 金幣+3, good！ 2013-07-15 11:24:25
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
藍(lán)月望寧: 金幣+5, ★有幫助, 謝謝，這個已經(jīng)注意了。不知道受體菌有什么要求？ 2013-07-15 09:22:46
laozuzunzhe: 金幣+3, good！ 2013-07-15 11:24:25
| 接合轉(zhuǎn)移應(yīng)該是鏈霉菌遺傳轉(zhuǎn)化方法里面比較好做，而且是轉(zhuǎn)化效率比較高的。我之前做這方面的，轉(zhuǎn)化成功了。接合轉(zhuǎn)移把握好以下幾個方面：受體形式，供體菌的培養(yǎng)時間，受體與供體的混合比例，抗生素覆蓋濃度，抗生素覆蓋時間這幾個因素應(yīng)該就沒問題，一個因素把握不好可能就做不出來。我當(dāng)時是對每個條件進(jìn)行了優(yōu)化。不同菌株的最優(yōu)化條件也不同，所以不知道樓主是問題出在哪一步了。 |
6樓2013-07-14 21:43:15
19樓2013-07-16 20:20:12
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多謝！ 是這樣的我們這個菌株還未公開，算是專利。。。。。并非我不信任您。 您說有做接合轉(zhuǎn)移的設(shè)備？這個還需要什么設(shè)備嗎？能否給我一份貴實驗室詳盡的實驗步驟，包括細(xì)節(jié)？ 感謝您的回復(fù)，如果可以成功我給您500金幣，說道做到。如果不方面的話我郵箱是lanyuekun@163.com，希望您能幫助！ |
3樓2013-07-13 20:39:33
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8樓2013-07-15 11:45:38
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9樓2013-07-15 16:48:53
10樓2013-07-15 18:37:35
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