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FAM熒光強(qiáng)度檢測(cè)數(shù)值問題 已有7人參與
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| 每次用酶標(biāo)儀檢測(cè)FAM熒光強(qiáng)度時(shí)，設(shè)置三組，一樣的東西為什么FAM的熒光值誤差那么大？檢測(cè)值為一萬多的時(shí)候誤差有3、4千，檢測(cè)值為2千的時(shí)候誤差有3、4百。。。請(qǐng)問是我加樣的原因還是數(shù)值本身太精確啊。。。 |
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8樓2013-07-22 20:10:21
real-time
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2樓2013-07-16 08:23:09
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3樓2013-07-16 08:48:57
凌波麗
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
myprayer: 金幣+1, 贈(zèng)人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩 2013-07-16 17:33:41
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Defintion of mPhotobleaching http://en.wikipedia.org/wiki/Photobleaching Photobleaching is the photochemical destruction of a dye or a fluorophore. In microscopy, photobleaching may complicate the observation of fluorescent molecules, since they will eventually be destroyed by the light exposure necessary to stimulate them into fluorescing. This is especially problematic in time-lapse microscopy. However, photobleaching may also be used prior to applying the (primarily antibody-linked) fluorescent molecules, in an attempt to quench autofluorescence. This can help to improve signal-to-noise ratio. Photobleaching may also be exploited to study the motion and/or diffusion of molecules, for example via the FRAP or FLIP techniques. Loss of activity caused by photobleaching can be controlled by reducing the intensity or time-span of light exposure, by increasing the concentration of fluorophores, by reducing the frequency and thus the photon energy of the input light, or by employing more robust fluorophores that are less prone to bleaching (e.g. Alexa Fluors or DyLight Fluors). To a reasonable approximation, a given molecule will be destroyed after a constant exposure (intensity of emission X emission time X number of cycles) because, in a constant environment, each absorption-emission cycle has an equal probability of causing photobleaching. Photobleaching是光漂白，光漂白影響的是熒光的消光系數(shù)，而不是熒光的波長(zhǎng)變化。 熒光光譜的形狀受到兩個(gè)因素影響：1.各振動(dòng)能級(jí)之間的跳躍概率，2.基態(tài)中的能級(jí)結(jié)構(gòu)。熒光分子受到激發(fā)之后，吸收光子的能量，躍遷到更高級(jí)的激發(fā)態(tài)，熒光的高級(jí)的激發(fā)態(tài)有較大的分布范圍，所以激發(fā)態(tài)光譜分布較寬，可能有存在多個(gè)吸收譜帶，再由不同的激發(fā)態(tài)能級(jí)躍遷到基態(tài)，每一種躍遷的能量釋放不同，所以可能有不同的激發(fā)態(tài)。俄而熒光物質(zhì)的振動(dòng)和內(nèi)轉(zhuǎn)化等非輻射的躍遷過程壽命很短，很快施放能量使分子衰變到激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，再有這個(gè)能級(jí)躍遷到基態(tài)，發(fā)射熒光分子。每一種熒光分子的激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)與基態(tài)中的能級(jí)的能量值基本上是不變的，所以兩者之間的差值決定了熒光分子的發(fā)射光譜，所以熒光分子的發(fā)射光譜的波長(zhǎng)一般比較窄，只有一個(gè)譜帶，與吸收光譜的波長(zhǎng)無關(guān)。熒光發(fā)射光譜與外界的熒光激發(fā)光譜之間的波長(zhǎng)通常有一定差值，叫所謂斯托克位移或者反斯托克位移，斯托克位移是熒光分子的發(fā)射波長(zhǎng)比激發(fā)波長(zhǎng)長(zhǎng)，反斯托克位移是熒光分子的發(fā)射波長(zhǎng)比激發(fā)波長(zhǎng)短。 但是也有一些熒光分子的分子存在特殊性，激發(fā)波長(zhǎng)變化時(shí)，熒光發(fā)射光譜會(huì)隨之變化，也就是該種熒光分子受激發(fā)出的熒光不全是該種熒光分子的激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)與基態(tài)中的能級(jí)之間能量差決定波長(zhǎng)的熒光。 所以一般如果出現(xiàn)了熒光分子受激后出現(xiàn)多個(gè)波長(zhǎng)時(shí)，盡量用一種外界的激發(fā)光譜（固定激發(fā)的光源）。 另外，熒光分子的具體的環(huán)境會(huì)引起Photobleaching（光漂白），尤其是針對(duì)某些波長(zhǎng)的熒光，當(dāng)有多個(gè)熒光時(shí)可能會(huì)剩下另外一些，有時(shí)高強(qiáng)度的熒光照射會(huì)引起Photobleaching（光漂白），熒光分子用量過大也會(huì)引起對(duì)某些發(fā)射波長(zhǎng)的熒光出現(xiàn)Photobleaching（光漂白）。 |
4樓2013-07-16 10:48:30
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