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[求助] 提取細(xì)菌基因組DNA時(shí)總是會(huì)有蛋白殘留

提取細(xì)菌基因組DNA時(shí)總是會(huì)有蛋白殘留，電泳時(shí)，用不同濃度的膠跑出來(lái)的效果差距也很遠(yuǎn)，左邊是0.6%的膠右邊是1.0%的膠，，加樣孔下方一點(diǎn)點(diǎn)的亮條帶是不是蛋白殘留的結(jié)果��？

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1樓 2013-07-17 16:25:31

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huanghznd

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植語(yǔ)(gyesang代發(fā)): 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖應(yīng)助！ 2013-07-17 16:37:10

是的。細(xì)菌基因組DNA時(shí)有蛋白殘留時(shí)，跑膠有拖帶的現(xiàn)象，膠濃度低，孔徑大，拖得更明顯。點(diǎn)樣孔下的殘留的就是蛋白�？梢杂梅勇确轮匦鲁樘�，可以去除一此蛋白。

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植語(yǔ)

2樓2013-07-17 16:32:58

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2樓: Originally posted by huanghznd at 2013-07-17 16:32:58
是的。細(xì)菌基因組DNA時(shí)有蛋白殘留時(shí)，跑膠有拖帶的現(xiàn)象，膠濃度低，孔徑大，拖得更明顯。點(diǎn)樣孔下的殘留的就是蛋白。可以用酚氯仿重新抽提，可以去除一此蛋白。

之前純化過(guò)，還是會(huì)有，后來(lái)?yè)Q了新的酚氯仿，好了一些，，但做PCR還是得不到目標(biāo)條帶，，，不知道多糖殘留會(huì)不會(huì)也是像圖中那樣，加樣孔下面一點(diǎn)點(diǎn)有亮帶，，還有，提的DNA用水溶解有時(shí)會(huì)很粘稠，不知道是殘留了什么？也很想知道我是用CTAB法提的DNA，不知道SDS和CTAB是在哪步被去除的，，是用異丙醇沉淀的時(shí)候溶解在了異丙醇里嗎？說(shuō)是CTAB易溶于異丙醇

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3樓2013-07-17 22:17:57

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fuyuandj86

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看看OD260/OD280的比例對(duì)不對(duì),就能確定蛋白殘留量有多少

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4樓2013-07-18 00:37:38

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引用回帖:

3樓: Originally posted by 植語(yǔ) at 2013-07-17 22:17:57
之前純化過(guò)，還是會(huì)有，后來(lái)?yè)Q了新的酚氯仿，好了一些，，但做PCR還是得不到目標(biāo)條帶，，，不知道多糖殘留會(huì)不會(huì)也是像圖中那樣，加樣孔下面一點(diǎn)點(diǎn)有亮帶，，還有，提的DNA用水溶解有時(shí)會(huì)很粘稠，不知道是殘留了什 ...

如果只是做PCR的模板，DNA不用很純，按照普通方法提就行了，也不用特意去掉殘留的蛋白和多糖。PCR中的模板所用的基因組DNA用量非常少，一般提出來(lái)的gDNA要經(jīng)過(guò)稀釋?zhuān)?xì)菌用1-10ng就夠了。

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5樓2013-07-18 01:48:32

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maidi12

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6樓2013-07-18 08:39:23

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成像的時(shí)候你是不是把托盤(pán)也放進(jìn)去了？
點(diǎn)樣孔有殘留首先要排除制膠的問(wèn)題，看marker孔是否也同樣殘留。
如排除膠的問(wèn)題，那建議用低濃度（0.6-0.8%）的膠，5V/cm慢慢跑。
不過(guò)其實(shí)有一點(diǎn)點(diǎn)蛋白殘留一般也不影響PCR。

另外就是在提取過(guò)程如果是酚/氯仿抽取時(shí)要充分振蕩、混勻而且吸取上清時(shí)注意不要吸到中間層的蛋白沉淀。

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7樓2013-07-18 10:14:30

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5樓: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-18 01:48:32
如果只是做PCR的模板，DNA不用很純，按照普通方法提就行了，也不用特意去掉殘留的蛋白和多糖。PCR中的模板所用的基因組DNA用量非常少，一般提出來(lái)的gDNA要經(jīng)過(guò)稀釋?zhuān)?xì)菌用1-10ng就夠了。...

DNA用量這么少？我跑PCR，25ul的體系，用的量在50ng左右是不是反而會(huì)出不了目標(biāo)條帶？

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8樓2013-07-18 14:53:13

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7樓: Originally posted by longrna at 2013-07-18 10:14:30
成像的時(shí)候你是不是把托盤(pán)也放進(jìn)去了？
點(diǎn)樣孔有殘留首先要排除制膠的問(wèn)題，看marker孔是否也同樣殘留。
如排除膠的問(wèn)題，那建議用低濃度（0.6-0.8%）的膠，5V/cm慢慢跑。
不過(guò)其實(shí)有一點(diǎn)點(diǎn)蛋白殘留一般也不影響 ...

想知道是不是提細(xì)菌基因組DNA一般都會(huì)有蛋白或其他雜質(zhì)殘留？

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9樓2013-07-18 14:54:05

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8樓: Originally posted by 植語(yǔ) at 2013-07-18 14:53:13
DNA用量這么少？我跑PCR，25ul的體系，用的量在50ng左右是不是反而會(huì)出不了目標(biāo)條帶？...

50ng是稍微多一點(diǎn)，不過(guò)也不算特別多，可以P出來(lái)的。

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10樓2013-07-19 01:03:09

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