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雪湛藍鐵桿木蟲 (正式寫手)
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[求助]
手提基因組方法遇到的問題
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自今年三月份開學(xué)以來，我用酚氯仿法手提一個細菌的基因組，在提的過程中，首先加入溶菌酶，帶菌體溶解后加入了10%的SDS，然后加入等體積氯仿和等體積的苯酚，離心后發(fā)現(xiàn)溶液分層，上下層透明，中間為白色蛋白質(zhì)，然而，當(dāng)我吸取上層液體時發(fā)現(xiàn)，上層不是水狀液體，而是果凍狀透明體，之后無論怎么吸都無可避免的會將白色蛋白質(zhì)吸上去，以至于后期處理無法進行，得不到想要的基因組。 但是上學(xué)期，我用此方法提取該菌的基因組時，相當(dāng)順利，也沒有果凍狀液體出現(xiàn)。有時認為是周圍環(huán)境溫度的問題，但是在冰上做也是得不到理想結(jié)果。所以在此求助大家，希望能得到解決辦法，或者大家能提供一個細菌基因組提取的方法。 |
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hsuley
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有幾點 1. SDS濃度是不是太高了？10%是母液濃度還是終濃度？一般終濃度1%就可以了。 2. SDS低溫下溶解度會下降的，所以建議控溫在20度左右裂解，而不是在冰上。 3. 有時候我在提取基因組的時候也會發(fā)現(xiàn)低溫離心后會在界面出現(xiàn)一些白色膜狀物，有時候不一定是蛋白質(zhì)，也可能是水相中低溫析出的溶解的酚，在加入乙醇或異丙醇后會溶解（蛋白不會溶解），不影響后續(xù)純化。 4. DNA樣品濃度大時本身就是粘度很大的，不用擔(dān)心，接著做就是了 |
3樓2012-06-06 21:26:57
8樓2013-03-02 17:14:56
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4樓2012-06-07 11:49:39
hsuley
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5樓2012-06-07 18:22:47
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6樓2012-06-08 09:01:11
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7樓2012-06-08 14:58:37
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9樓2013-03-03 11:47:25
【答案】應(yīng)助回帖
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樓主你好，首先非常感謝你能在百忙之中抽出時間看我的問題并耐心的給我回復(fù)，我真的非常感謝你，看完回復(fù)后我發(fā)現(xiàn)我的步驟沒有加入溶菌酶，為了更清楚的說明，我把整個步驟貼在了下面，里面只有用SDS及酚氯仿，我真誠的希望樓主根據(jù)我的步驟再給我提出指導(dǎo)性的意見，我也沒什么可以說的了，只有心中無限的感激之情或許能傳遞給樓主了，再次謝謝! 步驟：(1) 按 1%的接種量接種 Tx1 到裝有 5ml LB 培養(yǎng)基的試管中，30℃150rpm振蕩培養(yǎng)過夜，使其長至對數(shù)期。次日取 1ml 菌液于 1.5ml 離心管，10,000×g離心 1min 沉淀菌液。 (2) 棄上清，加 1ml 0.9% NaCl 將沉淀重懸浮，10,000×g 離心 3min。 (3) 棄上清，加 450μL TE 緩沖液（12 mM Tris-HCl，12mM EDTA， pH8.0）重懸浮，加 50μL 20% SDS，輕輕的上下顛倒離心管使之混勻，75℃水浴 5min(直至菌液裂解變?yōu)槌吻?。 (4) 加 500μL 3:1 的酚：氯仿抽提蛋白質(zhì)，輕輕上下顛倒使之混勻，10,000×g離心 5min。 (5) 輕輕吸取上清于一新的 1.5ml 離心管(注意不要吸到中間的蛋白質(zhì)) 并補足體積到 500μL，加 500μL 3:1 的酚:氯仿，10,000×g 離心 5 分鐘。吸上清，如此反復(fù)，直至看不到中間的蛋白質(zhì)層為止(注意盡量防止 DNA 在抽提中發(fā)生斷裂降解)。 (6) 吸取上清于一新的 1.5ml 離心管并補足體積到 500μL，加 500μL 氯仿，輕輕混勻，10,000×g 離心 5min。 (7) 吸取上清于一新的 1.5ml 離心管，加 1/10 體積 3M NaAc，然后加等體積的異丙醇，上下顛倒幾次，此時應(yīng)看到有絮狀沉淀產(chǎn)生，10,000×g 離心 5min。 (8) 將上清吸出，加 1ml 70%的乙醇清洗沉淀，10,000×g 離心 5min，去上清，室溫干燥。 (9) 加 50μL TE 緩沖液溶解沉淀，取 2μL電泳檢測 DNA 質(zhì)量及濃度。 |
10樓2013-03-04 23:00:00
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