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雪湛藍(lán)鐵桿木蟲 (正式寫手)
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[求助]
手提基因組方法遇到的問(wèn)題
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自今年三月份開(kāi)學(xué)以來(lái)，我用酚氯仿法手提一個(gè)細(xì)菌的基因組，在提的過(guò)程中，首先加入溶菌酶，帶菌體溶解后加入了10%的SDS，然后加入等體積氯仿和等體積的苯酚，離心后發(fā)現(xiàn)溶液分層，上下層透明，中間為白色蛋白質(zhì)，然而，當(dāng)我吸取上層液體時(shí)發(fā)現(xiàn)，上層不是水狀液體，而是果凍狀透明體，之后無(wú)論怎么吸都無(wú)可避免的會(huì)將白色蛋白質(zhì)吸上去，以至于后期處理無(wú)法進(jìn)行，得不到想要的基因組。 但是上學(xué)期，我用此方法提取該菌的基因組時(shí)，相當(dāng)順利，也沒(méi)有果凍狀液體出現(xiàn)。有時(shí)認(rèn)為是周圍環(huán)境溫度的問(wèn)題，但是在冰上做也是得不到理想結(jié)果。所以在此求助大家，希望能得到解決辦法，或者大家能提供一個(gè)細(xì)菌基因組提取的方法。 |
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8樓2013-03-02 17:14:56
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2樓2012-06-06 12:44:36
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有幾點(diǎn) 1. SDS濃度是不是太高了？10%是母液濃度還是終濃度？一般終濃度1%就可以了。 2. SDS低溫下溶解度會(huì)下降的，所以建議控溫在20度左右裂解，而不是在冰上。 3. 有時(shí)候我在提取基因組的時(shí)候也會(huì)發(fā)現(xiàn)低溫離心后會(huì)在界面出現(xiàn)一些白色膜狀物，有時(shí)候不一定是蛋白質(zhì)，也可能是水相中低溫析出的溶解的酚，在加入乙醇或異丙醇后會(huì)溶解（蛋白不會(huì)溶解），不影響后續(xù)純化。 4. DNA樣品濃度大時(shí)本身就是粘度很大的，不用擔(dān)心，接著做就是了 |
3樓2012-06-06 21:26:57
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4樓2012-06-07 11:49:39
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5樓2012-06-07 18:22:47
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9樓2013-03-03 11:47:25
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【答案】應(yīng)助回帖
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樓主你好，首先非常感謝你能在百忙之中抽出時(shí)間看我的問(wèn)題并耐心的給我回復(fù)，我真的非常感謝你，看完回復(fù)后我發(fā)現(xiàn)我的步驟沒(méi)有加入溶菌酶，為了更清楚的說(shuō)明，我把整個(gè)步驟貼在了下面，里面只有用SDS及酚氯仿，我真誠(chéng)的希望樓主根據(jù)我的步驟再給我提出指導(dǎo)性的意見(jiàn)，我也沒(méi)什么可以說(shuō)的了，只有心中無(wú)限的感激之情或許能傳遞給樓主了，再次謝謝! 步驟：(1) 按 1%的接種量接種 Tx1 到裝有 5ml LB 培養(yǎng)基的試管中，30℃150rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，使其長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期。次日取 1ml 菌液于 1.5ml 離心管，10,000×g離心 1min 沉淀菌液。 (2) 棄上清，加 1ml 0.9% NaCl 將沉淀重懸浮，10,000×g 離心 3min。 (3) 棄上清，加 450μL TE 緩沖液（12 mM Tris-HCl，12mM EDTA， pH8.0）重懸浮，加 50μL 20% SDS，輕輕的上下顛倒離心管使之混勻，75℃水浴 5min(直至菌液裂解變?yōu)槌吻?。 (4) 加 500μL 3:1 的酚：氯仿抽提蛋白質(zhì)，輕輕上下顛倒使之混勻，10,000×g離心 5min。 (5) 輕輕吸取上清于一新的 1.5ml 離心管(注意不要吸到中間的蛋白質(zhì)) 并補(bǔ)足體積到 500μL，加 500μL 3:1 的酚:氯仿，10,000×g 離心 5 分鐘。吸上清，如此反復(fù)，直至看不到中間的蛋白質(zhì)層為止(注意盡量防止 DNA 在抽提中發(fā)生斷裂降解)。 (6) 吸取上清于一新的 1.5ml 離心管并補(bǔ)足體積到 500μL，加 500μL 氯仿，輕輕混勻，10,000×g 離心 5min。 (7) 吸取上清于一新的 1.5ml 離心管，加 1/10 體積 3M NaAc，然后加等體積的異丙醇，上下顛倒幾次，此時(shí)應(yīng)看到有絮狀沉淀產(chǎn)生，10,000×g 離心 5min。 (8) 將上清吸出，加 1ml 70%的乙醇清洗沉淀，10,000×g 離心 5min，去上清，室溫干燥。 (9) 加 50μL TE 緩沖液溶解沉淀，取 2μL電泳檢測(cè) DNA 質(zhì)量及濃度。 |
10樓2013-03-04 23:00:00
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