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jonew木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
求大神支招
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| 剛剛?cè)氲�，做克隆，�?nèi)參可以P出來(lái)，但是目標(biāo)產(chǎn)物就是P不出來(lái)！而且PCR完了以后什么也沒(méi)有，（退火溫度、引物、模板濃度也調(diào)了幾次）。請(qǐng)問(wèn)哪位大神說(shuō)說(shuō)看下一步該怎么做？明天試著做溫度梯度PCR。 |
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 核酸生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) |
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2樓2013-07-18 00:16:31
gyesang
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4樓2013-07-18 02:42:15
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
jonew: 金幣+5 2013-07-18 17:37:30
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
jonew: 金幣+5 2013-07-18 17:37:30
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樓主的情況是不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，問(wèn)題與解決如下： PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有:1模板核酸的制備，2引物的質(zhì)量與特異性，3.酶的質(zhì)量，4. Mg2+ 濃度，5.物理原因，6.靶序列變異。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究，本帖最后寫(xiě)出了調(diào)整順序。 1.模板：(1)模板中含有雜蛋白質(zhì)，(2)模板中含有Taq酶抑制劑，(3)模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，(4)在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚。(5)模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處 理，模板核酸提取過(guò)程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改。 2.酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠�！� 3.引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱(chēng)，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不 理想、容易彌散的常見(jiàn)原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱(chēng)擴(kuò)增，對(duì)策為：(1)選定一個(gè)好的引物合成單位。(2)引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。(3)引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。(4)引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等�！� 4.Mg2+ 濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過(guò)高可降低PCR擴(kuò)增的特 異性，濃度過(guò)低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶�！ � 反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20μL、30μL、50μL�；�100μL，應(yīng)用多 大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20μL 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。 5.物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一�！ � 6.靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。 一般的調(diào)整順序：若PCR反應(yīng)后無(wú)任何產(chǎn)物，可先調(diào)整Mg2+ 濃度，Mg2+ 濃度不高于10.0mmol/L，不低于1.0mmol/L，調(diào)整時(shí)從低往高分梯度加，每次升高0.05mmol/L.最常使用Mg2+ 濃度為1.5mmol/L。 然后調(diào)整引物濃度，在調(diào)整引物與模板的結(jié)合溫度。再往后，重新提取DNA模板、換酶和改變反應(yīng)體積。最后這些都做了仍未奏效，那么就要重新設(shè)計(jì)引物了。 過(guò)去，我也回答過(guò)PCR無(wú)產(chǎn)物的問(wèn)題，但是這次回答按照近日我更新以后的內(nèi)容回答。 |
6樓2013-07-18 15:55:03
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