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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 求大神支招
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jonew木蟲 (正式寫手)
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[求助]
求大神支招
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| 剛剛入道，做克隆，內參可以P出來，但是目標產物就是P不出來！而且PCR完了以后什么也沒有，（退火溫度、引物、模板濃度也調了幾次）。請問哪位大神說說看下一步該怎么做？明天試著做溫度梯度PCR。 |
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 核酸生物學實驗經驗 |
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【答案】應助回帖
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感謝參與，應助指數(shù) +1
jonew: 金幣+5 2013-07-18 17:37:30
感謝參與，應助指數(shù) +1
jonew: 金幣+5 2013-07-18 17:37:30
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樓主的情況是不出現(xiàn)擴增條帶，問題與解決如下： PCR反應的關鍵環(huán)節(jié)有:1模板核酸的制備，2引物的質量與特異性，3.酶的質量，4. Mg2+ 濃度，5.物理原因，6.靶序列變異。尋找原因亦應針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究，本帖最后寫出了調整順序�！� 1.模板：(1)模板中含有雜蛋白質，(2)模板中含有Taq酶抑制劑，(3)模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，(4)在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。(5)模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應 固定不宜隨意更改。 2.酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。 3.引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：(1)選定一個好的引物合成單位。(2)引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。(3)引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。(4)引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等�！� 4.Mg2+ 濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶�！ � 反應體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20μL、30μL、50μL�；�100μL，應用多 大體積進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20μL 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。 5.物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一�！ � 6.靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。 一般的調整順序：若PCR反應后無任何產物，可先調整Mg2+ 濃度，Mg2+ 濃度不高于10.0mmol/L，不低于1.0mmol/L，調整時從低往高分梯度加，每次升高0.05mmol/L.最常使用Mg2+ 濃度為1.5mmol/L。 然后調整引物濃度，在調整引物與模板的結合溫度。再往后，重新提取DNA模板、換酶和改變反應體積。最后這些都做了仍未奏效，那么就要重新設計引物了。 過去，我也回答過PCR無產物的問題，但是這次回答按照近日我更新以后的內容回答。 |
6樓2013-07-18 15:55:03
bullfrog325
木蟲 (正式寫手)
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4樓2013-07-18 02:42:15
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