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關(guān)于western相關(guān)試劑材料的選擇（轉(zhuǎn)） 已有7人參與
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1、樣品的制備：仍然是選擇RIPA裂解液和PMSF作為黃金搭檔，經(jīng)費(fèi)充足的實(shí)驗(yàn)室考慮特異性的蛋白酶抑制劑cocktail，磷酸酶抑制劑就不需要特別添加了，因?yàn)镽IPA裂解液里面一般都含有NaF，我覺得應(yīng)該足夠了。因?yàn)楸淘铺炖锩娴牡鞍琢呀庖罕容^便宜，很多客戶會(huì)選擇這個(gè)公司的產(chǎn)品，在這當(dāng)中有些客戶唯恐提的蛋白有大的損失，喜歡用強(qiáng)的RIPA裂解液，覺得裂解的越徹底越好，結(jié)果得到的裂解產(chǎn)物里面有很多膠凍樣的粘稠物，這些東西可能是細(xì)胞核里面DNA，有時(shí)候離心都難離下來(lái)，特別是提細(xì)胞全蛋白的時(shí)候，在此希望客戶按部就班的選擇合適的裂解液，不是越強(qiáng)越好。如果檢測(cè)的目的蛋白不是部分或者全部位于細(xì)胞核內(nèi)，我一般不建議用這種強(qiáng)的RIPA裂解液。另外，檢測(cè)特異部位蛋白的表達(dá)情況，比如線粒體，細(xì)胞核，細(xì)胞膜等部位，要根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的提取試劑盒，我看國(guó)內(nèi)有好多公司都會(huì)提供相應(yīng)的試劑盒，上海生工，南京凱基，碧云天都有，和國(guó)外pierce這些廠家的提取試劑盒相比，效果怎么樣，我沒有比較過(guò)，就不發(fā)表評(píng)論。順便提一下，這樣部位內(nèi)參的選擇，經(jīng)費(fèi)充足的實(shí)驗(yàn)室，可以選擇特異的內(nèi)參，比如組蛋白作為核蛋白內(nèi)參，離子通道蛋白作為膜內(nèi)參。當(dāng)然，用胞漿蛋白GAPDH或者beta-actin，作為內(nèi)參，我個(gè)人覺得也沒有大問(wèn)題，解釋呢是提取的蛋白過(guò)程中會(huì)有固定比例的胞漿蛋白的污染。另外，選擇進(jìn)口膜蛋白提取試劑盒，一定要慎重，仔細(xì)看一下說(shuō)明書再確定是否購(gòu)買，現(xiàn)在國(guó)外膜蛋白提取試劑盒得到大家公認(rèn)的是sigma，merck和piece公司，但是前面兩個(gè)對(duì)離心的條件非常苛刻，大部分實(shí)驗(yàn)室達(dá)不到這個(gè)條件，而pierce的要求則不那么苛刻。 2、蛋白的定量：這一步也是非常重要的，作為后面加樣，確定每孔加樣體積的參考依據(jù)很重要。很多教科書都寫一孔加30-100ug就可以了。每孔也不是加的蛋白量越大越好。蛋白定量試劑盒，用國(guó)產(chǎn)的就可以了，上海生工，碧云天，上海博彩的都還不錯(cuò)。 3、蛋白上樣緩沖液：不管是2*的還是5*的，不管是自己配的還是從公司購(gòu)買的，都差不多，因?yàn)榕浞缴蠜]有什么大的差別，足量的溴酚藍(lán)，還原劑beta-巰基乙醇，帶動(dòng)蛋白下沉的甘油等等。這里有個(gè)問(wèn)題，客戶經(jīng)常問(wèn)我，我也不知道答案。提好的蛋白定完量后，和上樣緩沖液一起煮過(guò)再保存，是不是更好？ 4、SDS-PAGE配膠系列：sigma和bio-rad，都有，東西很好，但是我這邊的客戶很少會(huì)選擇這兩個(gè)廠家，因?yàn)閮r(jià)格太貴，而且分裝的配膠相關(guān)的試劑或者碧云天的配膠試劑盒，做出來(lái)的蛋白電泳圖片，也是非常漂亮的，No problem。甘氨酸、tris-堿，SDS這些對(duì)試劑的級(jí)別要求不是很高，選擇分裝的，ok。 5、蛋白marker：對(duì)于，western blot檢測(cè)來(lái)說(shuō)，一般會(huì)選擇彩虹蛋白marker或者發(fā)光marker，這兩種marker各有優(yōu)勢(shì)。彩虹蛋白marker，可以幫助判斷電泳時(shí)間是否到位，轉(zhuǎn)膜是否成功以及準(zhǔn)確的裁膜，這對(duì)一次電泳同時(shí)檢測(cè)幾個(gè)指標(biāo)非常重要。在這里不得不提到Fermentas的經(jīng)典之作，SM0671，10-170kd，覺得非常經(jīng)典，指示的非常清楚，這個(gè)品牌旗下其他貨號(hào)的彩虹marker和它比，都很遜色。發(fā)光蛋白marker則可以準(zhǔn)確的在膠片上顯示目的條帶的大概分子量，在發(fā)表的文章上面顯示出來(lái)，個(gè)人感覺增色不少。在蛋白marker的選擇上，存在著一個(gè)誤區(qū)，好多客戶總是非常挑剔的去選擇具有和自己檢測(cè)的目的蛋白最相近的條帶的marker，其實(shí)在western bolt檢測(cè)中，我覺得一點(diǎn)必要沒有。western blot檢測(cè)過(guò)程中抗體結(jié)合的特異性決定了檢測(cè)的特異性，以及抗體說(shuō)明書里面的對(duì)目的條帶位置的描述用到的“approximately”這個(gè)字眼，就絕對(duì)marker只起到大體的參考作用就可以了。 6、轉(zhuǎn)膜過(guò)程中濾紙和膜的選擇：濾紙就選擇whatman 的3M濾紙。膜到底選擇Nc膜還是PVDF膜，就和選擇蘿卜還是白菜一樣，看個(gè)人的喜好了，雖然資料里面寫的是PVDF膜對(duì)蛋白具有更強(qiáng)的結(jié)合力。對(duì)于小分子的蛋白的檢測(cè)，推薦選擇0.22um 孔徑的膜，另外及時(shí)調(diào)整轉(zhuǎn)膜電壓和時(shí)間，防止蛋白穿透。 7、封閉：脫脂奶粉（國(guó)產(chǎn)的光明牌據(jù)說(shuō)還不錯(cuò)）還是粗制的BSA，都可以。如果后面檢測(cè)發(fā)現(xiàn)背景很深，其他抗體濃度等條件也調(diào)整過(guò)后，還是不見效的的情況下，就可以選擇另外一種封閉條件試試看。 8、一抗：western blot檢測(cè)中最燒錢的一抗閃亮登場(chǎng)了，這個(gè)話題永遠(yuǎn)都是討論的最多的。下面這幾個(gè)廠家的抗體還是我比較喜歡并樂(lè)意推薦給客戶的，CST，Millipore旗下的chemicon產(chǎn)品，RnD，Abcam，Sigma，epitomics，santa cruz的都還可以。這里簡(jiǎn)單的提到兩個(gè)公司的產(chǎn)品，CST和santa cruz，其余的有空再長(zhǎng)長(zhǎng)的寫一篇。CST抗體，質(zhì)量好，性價(jià)比高，信號(hào)通路方面比較全，而且抗體效價(jià)比較穩(wěn)定，一般1：1000稀釋去做，不需要怎么去摸條件，缺點(diǎn)是抗體的種類大部分集中在信號(hào)通路方面，相對(duì)來(lái)說(shuō)品種少了，另外一個(gè)不得不說(shuō)的就是CST抗體的投訴率雖然比較低，但是投訴成功率也不高，這樣讓我們中間的試劑商很難做，聽說(shuō)吉泰從去年因?yàn)檫@個(gè)原因退出了對(duì)CST的代理。Santa cruz的抗體，的確投訴率很高，現(xiàn)在在客戶當(dāng)中的口碑也不怎么好，那些因?yàn)閺钠渌麕讉�(gè)大公司買不到自己所需的抗體的客戶，不得不選擇santa cruz抗體做實(shí)驗(yàn)的客戶，往往帶著有色眼鏡去對(duì)待它，很多時(shí)候不愿意花多的精力去優(yōu)化條件。但是santa的抗體，也有優(yōu)點(diǎn)，品種全，售后服務(wù)好，權(quán)威文獻(xiàn)里面應(yīng)用的也很多，投訴成功率還是比較高的，呵呵。內(nèi)參抗體的選擇，有錢的客戶可以選擇進(jìn)口的大品牌，經(jīng)費(fèi)緊張的選擇杭州賢至，杭州華安的也不錯(cuò)。上面廢話太多了，下面簡(jiǎn)單點(diǎn)。 9、抗體稀釋液：碧云天的就可以，實(shí)用。 10、HRP標(biāo)記的二抗：國(guó)產(chǎn)的足夠。不放心的話，可以用國(guó)內(nèi)試劑商分裝的jackson二抗，真的還不錯(cuò)，效價(jià)高，價(jià)格低。 11、ECL：推薦pierce的貨號(hào)34079，34080。Thermo pierce前兩年，推出來(lái)的專門針對(duì)中國(guó)客戶的super ECl，價(jià)格的確便宜了很多，但是和pierce原裝的比，真的不是一個(gè)檔次，表現(xiàn)為淬滅的非常快。不客氣的說(shuō)，比較坑人。12、膠片：柯達(dá)和富士的都可以。 13、顯影定影粉：天津產(chǎn)的就可以。 |
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