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joyjane88銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
有關(guān)EMSA（凝膠阻滯）的，是否有aEMSA（高濃度瓊脂糖凝膠阻滯）這種技術(shù)？
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| 最近老板要求做EMSA，實驗室沒有任何經(jīng)驗。聽著同位素和DIG又貴有麻煩，同位素還危險。從一篇中文文獻（Sample Text喜鹽芽孢桿菌甘氨酸甜菜堿合成基因的克隆與功能分析）上看到有人直接用1.5%瓊脂糖凝膠做凝膠阻滯，DNA探針不用標(biāo)記，跑完膠直接掃膠，似乎做得也想那么回事。但查一下網(wǎng)上的EMSA幾乎沒有用這種簡單的方法的。有誰能對這個方法給個解釋？最關(guān)注這么做是否可行，其次想知道如果可行是否和標(biāo)記探針的EMSA實驗在細節(jié)上有什么差別。任何經(jīng)驗的回復(fù)都不勝感激�。。�Sample TextSample TextSample Text |
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adslye
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2樓2011-08-30 10:51:53
joyjane88
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3樓2011-10-07 19:35:18
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adslye(金幣+2): 鼓勵交流~不過如果精簡，處理下帖子內(nèi)容就好了~ 2011-10-08 19:30:33
joyjane88(金幣+1): 答非所問 2011-10-12 13:20:38
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joyjane88(金幣+1): 答非所問 2011-10-12 13:20:38
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凝膠阻滯（遷移） 實驗名稱 實驗內(nèi)容 客戶提供材料 服務(wù)期限 提交結(jié)果 服務(wù)報價 凝膠阻滯（遷移）實驗 EMSA KGSP010 核蛋白提取 細胞或組織樣本 3天 核蛋白定量結(jié)果 120元/樣本 預(yù)實驗 指標(biāo)信息、一抗等 2周 800元/蛋白 正式實驗 一抗 2-8周 （視樣本數(shù)定） ECL顯色結(jié)果 1000元/膜，最多可做八個樣品 實驗?zāi)康模簷z測待測樣品中特定目的核蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。 實驗原理：蛋白質(zhì)可以與末端標(biāo)記的核酸探針結(jié)合，在瓊脂糖膠或非變性膠中電泳時這種復(fù)合物比無蛋白結(jié)合的探針在凝膠中泳動的速度慢，即表現(xiàn)為相對滯后。該方法可用于檢測DNA結(jié)合蛋白、RNA結(jié)合蛋白，并可通過加入特異性的抗體（supershift）來檢測特定的蛋白質(zhì)，進行未知蛋白的鑒定。 實驗材料： 試劑：核蛋白提取試劑盒、bradford法蛋白含量測定試劑盒、生物素標(biāo)記 3’端 DNA試劑盒、Lightshift EMSA Optimization & Control Kit、化學(xué)發(fā)光法核酸檢測試劑盒。 儀器：恒溫培養(yǎng)箱、蛋白電泳儀、低溫冰箱。恒溫水浴箱、紫外交聯(lián)燈、振蕩器、脫色搖床。 實驗內(nèi)容與方法： 1、 核蛋白樣本提取與蛋白定量。 2、 生物素標(biāo)記DNA3’端并去吹TdT。 3、 Super-Shift反應(yīng)，配制6.5%聚丙烯酰胺凝膠，配制好各反應(yīng)體系，EMSA室溫結(jié)合反應(yīng)20min，電泳上樣。 4、 電轉(zhuǎn)膜，操作方法同常規(guī)Western blot轉(zhuǎn)膜操作。 5、 紫外交聯(lián)，將核酸交聯(lián)于PVDF膜上。 6、 化學(xué)發(fā)光法檢測生物素標(biāo)記的探針。 客戶提供實驗信息： 1、 實驗信息 樣本來源： 細胞 種屬來源__________ or 組織 組織來源_________ 樣本數(shù)量：__________ 檢測蛋白信息：目的蛋白名稱_______________ 蛋白分子量_________ 2、實驗材料 （1）樣本材料 新鮮或冷凍細胞不少于106個，新鮮或冷凍組織樣本不少于50 mg。 已提取的蛋白樣品蛋白含量不低于0.1ug/ul。 （2）試劑：蛋白提取與定量可根據(jù)客戶要求選用特定試劑盒，如客戶不提供 試劑盒且無特別要求，則選用凱基公司相應(yīng)試劑盒產(chǎn)品。Super-shift反應(yīng)所用試劑盒同上，凱基也可以提供試劑盒代訂服務(wù)。 服務(wù)周期：（2到8周，根據(jù)樣本數(shù)量而定） 結(jié)果提交：提交實驗報告書（包括實驗材料、試劑、儀器、實驗過程方法、結(jié)果及分析）、原始數(shù)據(jù)、圖片，文本或電子版。 收費標(biāo)準與付費方式： 核蛋白提取 （核蛋白提取及蛋白定量結(jié)果，100元/樣） 預(yù)實驗 （客戶提供一抗，800元/膜） 正式實驗 （客戶提供一抗。1000元/膜，每張膜最多8個樣） 實驗范例： 細胞中AP-1蛋白轉(zhuǎn)錄活性實驗 灰度分析 樣品編號 陽性面積 陽性平均灰度 背景灰度 凈灰度 陽性灰度積 空白 1450 176 176 0 0 1 3177 209 175 34 108018 2 6553 211 175 36 235908 3 4995 199 174 25 124875 4 5618 211 174 37 207866 5 1936 182 173 9 17424 6 4752 197 172 25 118800 7 4547 202 171 31 140957 8 4967 196 171 25 124175 9 1854 175 170 5 9270 10 5210 187 170 17 88570 11 6360 200 170 30 190800 12 4863 198 170 28 136164 陽性對照 7519 201 170 31 233089 競爭 4057 197 171 26 105482 |
4樓2011-10-08 09:10:12
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