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學(xué)術(shù)問(wèn)題銀蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
新手 熒光定量模板 問(wèn)題？ 切切�。�
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首先：我的對(duì)照組：把第0,1 2 ，……40天RNA進(jìn)行等量混合后得到RNA混合樣品 CK:濃度是284.6。。。（每天取400ng等量混合） 其次：實(shí)驗(yàn)組：也是第0,1,2，……40天RNA樣品混合后得到RNA混合樣品CU：濃度是322.4。。。（也是每天取400ng等量混合） 但是由于反轉(zhuǎn)錄效率等一系列原因 造成最后 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組反轉(zhuǎn)錄后cDNA濃度不一樣。 問(wèn)題就來(lái)了：那么我上熒光的時(shí)候需不需要把實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的模板 即：加的CDNA量 必須一致嗎？？比如 實(shí)驗(yàn)組模板cDNA加100ng，對(duì)照組也加模板cDNA 100ng。（如果不一樣的話(huà)，那么本來(lái)實(shí)驗(yàn)組a基因表達(dá)微弱，但是加的模板比較多，所以檢測(cè)出來(lái)就比對(duì)照組表達(dá)高） 不知道我的想法對(duì)不對(duì)呢？？？急急急 |
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cicelyzh
鐵桿木蟲(chóng) (職業(yè)作家)
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
學(xué)術(shù)問(wèn)題(myprayer代發(fā)): 金幣+2, 贈(zèng)人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩。 2013-07-26 08:58:32
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| 反轉(zhuǎn)錄出來(lái)的cDNA樣品的濃度根本不能定，因?yàn)橛蠷NA和dNTP干擾。想比較的樣品需要同時(shí)反轉(zhuǎn)錄，取相同量的RNA為模板。做絕對(duì)定量的話(huà)就只能靠這么做了，如果是相對(duì)定量，需要和內(nèi)參比，就會(huì)消除因模板量稍有差異對(duì)結(jié)果的影響了。 |
2樓2013-07-26 01:16:20
學(xué)術(shù)問(wèn)題
銀蟲(chóng) (小有名氣)
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3樓2013-07-26 08:29:10
cicelyzh
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【答案】應(yīng)助回帖
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學(xué)術(shù)問(wèn)題: 金幣+5, ★★★很有幫助 2013-07-26 11:09:17
kx444555: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2013-07-26 11:22:54
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kx444555: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流 2013-07-26 11:22:54
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不是這個(gè)意思。做定量要讓模板的量是一致的，如果模板量相差很多會(huì)直接影響到擴(kuò)增效率。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性好擴(kuò)增效率接近1也是在一定范圍內(nèi)的。但是從RNA反轉(zhuǎn)錄來(lái)的cDNA不能直接定量，需要消化掉RNA并經(jīng)過(guò)純化才能定量，沒(méi)有人這樣去做的。cDNA樣品不能直接定量原因我前面已經(jīng)解釋了。所以要用同樣量的RNA做反轉(zhuǎn)錄，為了保證效率一致，需要比較的樣品最好同時(shí)做反轉(zhuǎn)錄。用內(nèi)參去消除樣品之間的微量差別也就是1與0.9，0.8的差別，不是1與10的差別。 |
4樓2013-07-26 09:42:37
學(xué)術(shù)問(wèn)題
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6樓2013-07-26 15:12:20
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7樓2013-07-26 19:48:22
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