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[求助]
ALP活性檢測(cè)中細(xì)胞裂解問題
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| 大家好，想請(qǐng)教一下做ALP 活性檢測(cè)時(shí)大家一般都用的什么方法來裂解細(xì)胞的，我看文獻(xiàn)里面有各種不同的方法，但是都沒有很詳細(xì)的信息，比如Freezing-Thawing,那這個(gè)冷凍和解凍的時(shí)間各是多少呢?另外就是用Triton,0.2%,0.5%的都有，但不知道哪個(gè)效果比較好，已經(jīng)多長(zhǎng)時(shí)間比較適宜呢？另外，用triton進(jìn)行裂解時(shí)是否應(yīng)該在冰上操作呢？另外就是因?yàn)橐鯝LP活性檢測(cè)，想了解下Triton的量對(duì)實(shí)驗(yàn)會(huì)不會(huì)有影響， 因?yàn)槲业募?xì)胞數(shù)量較多，用的是24孔板，所以擔(dān)心100uL的Triton不能降細(xì)胞完全裂解，所以想說用200uL或是500uL的量是不是也可以，最后各取出50uL來做BCA和ALP活性的測(cè)試。還有就是關(guān)于細(xì)胞裂解后是否需要離心的問題，我現(xiàn)在是裂解后就直接取出上層液進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，沒有離心，也沒有在取細(xì)胞液時(shí)將孔板混勻（因?yàn)閾?dān)心細(xì)胞碎片會(huì)漂到上層），不知道這樣可不可以的。另外還有個(gè)最重要的問題，想請(qǐng)問下有沒有人拍過細(xì)胞裂解后的形貌照片的，因?yàn)槲野l(fā)現(xiàn)我的細(xì)胞裂解半小時(shí)后好像還是完整的細(xì)胞，不知道是不是我的細(xì)胞根本沒用裂解完全，所以想知道裂解后細(xì)胞應(yīng)該是個(gè)什么樣子。非常感謝！ |
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2樓2013-07-26 10:04:42
送紅花一朵 |
你好，非常感謝哦！那就是說取出多少量來做ALP檢測(cè)或是蛋白活性檢測(cè)是沒有影響的是嗎？?jī)鋈谶^程是經(jīng)過-70℃和37℃反復(fù)的對(duì)嗎，那就是整個(gè)凍融過程就是讓它完全凍住和完全溶解是吧，溶解過程需要水浴加熱不呢？但是不是溫度太高會(huì)影響蛋白的活性么？ 那你把細(xì)胞全部吹大下來后應(yīng)該還要離心吧，你采用的離心條件是什么呢，一定要四度不？ 另外不知道你測(cè)ALP活性的時(shí)候是用的試劑盒還是自己配置的，我看p-NP標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制這一塊，有的是把p-NP的儲(chǔ)存液用buffer稀釋到一定的濃度范圍，有的確是用NaOH溶液（也就是反應(yīng)終止液）來稀釋到一定的濃度范圍，所以我都很迷惑了。 另外不知道你有沒有做過ALP染色的呢，我用的是BCIP/NTB來染的，但染出來怎么是藍(lán)色的，感覺挺奇怪。 問題有點(diǎn)多，麻煩你了哦！再次感謝！ |
3樓2013-07-26 16:46:33
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8樓2013-08-07 17:38:46
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