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歐陽(yáng)-90

銀蟲(chóng) (小有名氣)

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【答案】應(yīng)助回帖

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4樓: Originally posted by 蛋炒飯1989 at 2013-07-31 12:26:37
是在上清中，我的蛋白需要活性...

標(biāo)簽純化不是唯一的方法，就算是原核重組蛋白，同樣我們可以考慮使用其他方法純化，比如初步硫酸銨沉淀，結(jié)合其他的層析方法進(jìn)行純化。只是你可能需要摸索的時(shí)間會(huì)多一點(diǎn)

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11樓2013-08-01 09:06:20

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睿智的銳志

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★ ★ ★
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蛋炒飯1989: 金幣+4 2013-08-01 20:21:57

簡(jiǎn)單點(diǎn)，如何知道你的蛋白是折進(jìn)去了？另外你的蛋白是什么可以讓我們更好地判斷情況。

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12樓2013-08-01 15:47:35

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蛋炒飯1989

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12樓: Originally posted by 睿智的銳志 at 2013-08-01 15:47:35
簡(jiǎn)單點(diǎn)，如何知道你的蛋白是折進(jìn)去了？另外你的蛋白是什么可以讓我們更好地判斷情況。

變性的可以掛到柱子上，不變性的掛不上去。我提的蛋白是一種酶，以后要放到電極上檢測(cè)底物，所以對(duì)活性要求比較高

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春暖花開(kāi)

13樓2013-08-01 20:21:47

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蛋炒飯1989

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9樓: Originally posted by bullfrog325 at 2013-07-31 17:48:00
我想到4個(gè)辦法:
辦法1: 把發(fā)HIS換成GST, 因?yàn)镚ST自己有結(jié)構(gòu), 缺點(diǎn)是對(duì)目標(biāo)蛋白的功能結(jié)構(gòu)可能有破壞性的影響.
辦法2: 在HIS和目標(biāo)蛋白之間加linker, 比方說(shuō)GGSGGSGGS, 使得HIS和目標(biāo)蛋白的距離疏遠(yuǎn)些從而有機(jī)會(huì)不 ...

這些個(gè)對(duì)我們實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)貌似挺難的……我現(xiàn)在時(shí)間比較緊，明年年初就畢業(yè)了，所以想要找個(gè)簡(jiǎn)便的方法，謝謝你哈

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春暖花開(kāi)

14樓2013-08-01 20:24:48

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蛋炒飯1989

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2樓: Originally posted by bleach060452 at 2013-07-31 11:43:14
看你蛋白用來(lái)干啥了，要不要活性？

至于蛋白的分離純化，這也不屬于分子生物學(xué)的~~想用其他方法純化，那就需要看你蛋白的特性、雜蛋白的影響了

以后要放到電極上做傳感器，對(duì)活性要求比較高。

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春暖花開(kāi)

15樓2013-08-01 20:25:35

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bullfrog325

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【答案】應(yīng)助回帖

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14樓: Originally posted by 蛋炒飯1989 at 2013-08-01 20:24:48
這些個(gè)對(duì)我們實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)貌似挺難的……我現(xiàn)在時(shí)間比較緊，明年年初就畢業(yè)了，所以想要找個(gè)簡(jiǎn)便的方法，謝謝你哈...

既然蛋白是一種酶, 那就用先變性純化再然后再?gòu)?fù)性的辦法吧, 以酶活度來(lái)判斷復(fù)性的好壞.

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16樓2013-08-01 22:43:10

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Sthunder

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關(guān)于方法上面說(shuō)得都蠻多的了，在此就沒(méi)必要贅述。我覺(jué)得在做之前希望LZ認(rèn)真確定自己蛋白是否真的被表達(dá)，因?yàn)镹,C兩端都被包被的可能性真的很少！Good luck！

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互助互勵(lì)，共奮共進(jìn)�。�

17樓2013-08-02 04:36:18

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roomofxw

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時(shí)間來(lái)不及，更要實(shí)驗(yàn)更得設(shè)計(jì)的仔細(xì)了，多看看相關(guān)文獻(xiàn)。
0.看起來(lái)酶活很重要，是否一定需要純化的很純
1.是酶的話，純化前的粗酶液是否有活性？
2.純化后不掛柱子的流穿是否有酶活？
3.可溶形式的聚集，可能是非共價(jià)鍵造成的聚集，嘗試改變buffer是不是會(huì)起作用
4.變性可以掛柱，那嘗試加入低濃度的變性劑是否可以純化。純化后是否還有活性，低濃度尿素緩慢透析能否比較容易的復(fù)性
5.蛋白分子量結(jié)構(gòu)如何，是否需要形成二聚之類(lèi)的，是否可以嘗試復(fù)性
6.既然是酶，還有傳感器，那你們測(cè)酶活會(huì)很容易。實(shí)驗(yàn)中從發(fā)酵開(kāi)始多取樣檢測(cè)酶活，看看問(wèn)題出在哪里

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18樓2013-08-02 08:56:34

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Allen206

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【答案】應(yīng)助回帖

請(qǐng)問(wèn)你是如何確定標(biāo)簽包被的？4如果真是包被就換標(biāo)簽，這是一個(gè)可行方法，或者就無(wú)標(biāo)簽，不過(guò)純化起來(lái)難度變大了，也要看情況

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不想說(shuō)什么，，，，

19樓2013-10-10 15:17:31

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