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12108080銀蟲 (小有名氣)
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量子點(diǎn)通過鏈霉親和素-生物素反應(yīng)連接抗體，怎么分離
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| 我的量子點(diǎn)上聯(lián)有鏈霉親和素，抗體上有生物素，現(xiàn)在想探索二者合適的比例使其充分連接，盡量減少浪費(fèi)。但是我不知道用什么手段檢測量子點(diǎn)是否結(jié)合上抗體，結(jié)合了多少。 所以請教大牛，通常用什么方法檢測？ 還有，有沒有什么方法，能把我需要的偶聯(lián)抗體的量子點(diǎn)分離出來呢？各位出來幫幫忙呀，剛開始做實(shí)驗(yàn)一個月了還兩眼抓瞎呢 |
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你連接成功量子點(diǎn)沒有？如果沒有的話，我把量子點(diǎn)制備的proteocols發(fā)給你，我最近也在開展量子點(diǎn)方面的實(shí)驗(yàn)，不過不好意思，我可沒有時間量子點(diǎn)制備的proteocols全部譯成中文。 我就樓主提問提示如下： 一、分離鏈霉親和素-量子點(diǎn)和生物素-抗體的聚合體： 1.用分子篩層析分離鏈霉親和素-量子點(diǎn) 和 生物素-抗體的地合體。你的量子點(diǎn)上聯(lián)有鏈霉親和素，抗體上有生物素，這就是一個受體-配體結(jié)合的實(shí)驗(yàn)檢測，方法很多，用分子篩層析可以分離出鏈霉親和素上和生物素-抗體形成的聚合體，先分別用兩者游離狀態(tài)走一遍分子篩層析，然后通過分子量的變化，可以分離出締合體。 我不知道你用的是哪種量子點(diǎn)，一般的話，量子點(diǎn)的直徑已經(jīng)是4-10nm，再加上連接的生物分子，體積更大，用透析或者超濾可能無法只透過量子點(diǎn)，如果孔徑能夠透過量子點(diǎn)，可能蛋白質(zhì)分子也會透過，所以不推薦使用透析或者超濾除去量子點(diǎn)。 2.Pull down分離鏈霉親和素-量子點(diǎn)和生物素-抗體的聚合體。既然量子點(diǎn)-鏈霉親和素結(jié)合到生物素-抗體上，那么你可以直接設(shè)計親和抗體的那種Pull down，可以把鏈霉親和素共價連接到層析柱上。就可以把兩者的聚合體一起從溶液中拽出來。在洗脫到溶液里即可。但是洗脫時會有鏈霉親和素-量子點(diǎn)和生物素-抗體的聚合體被拆解。 3.用超速離心分離鏈霉親和素-量子點(diǎn) 和 生物素-抗體的聚合體可以嘗試，但是超速離心肯定會把一些鏈霉親和素-量子點(diǎn) 和 生物素-抗體的聚合體重新拆解開。 所以推薦分子篩層析。因?yàn)槟闶且蛛x出來分離鏈霉親和素-量子點(diǎn) 和 生物素-抗體的聚合體，而不是僅僅鑒定離職你跟著發(fā)生了聚合。 二、測定用什么手段檢測量子點(diǎn)結(jié)合了多少抗體？ 當(dāng)然要在第一步分離出來分離 鏈霉親和素-量子點(diǎn) 和 生物素-抗體 的聚合體 之后再來做。 方法有很多種。說一種最簡單的方法： 分子篩層析可以分離出鏈霉親和素-量子點(diǎn)和生物素-抗體形成的聚合體，這步操作可以重復(fù)進(jìn)行，多次混合鏈霉親和素上和生物素-抗體，室溫下溫和攪拌，以便鏈霉親和素上和生物素-抗體形成聚合體，然后走分子篩層析，多操作幾次。提示一下：當(dāng)鏈霉親和素-量子點(diǎn)和生物素-抗體形成聚合體時，鏈霉親和素-量子點(diǎn) 和 生物素-抗體兩種物質(zhì)首先要提純，不然發(fā)生相互作用時干擾巨多。然后用紫外光譜儀測定游離的鏈霉親和素-量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，除以鏈霉親和素-量子點(diǎn)的分子量，得出單個的鏈霉親和素-量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，再用熒光光譜儀測定鏈霉親和素-量子點(diǎn) 和 生物素-抗體的熒光強(qiáng)度，是先要測定出生物素-抗體的數(shù)量，然后測定出：用分子篩層析分離出的鏈霉親和素-量子點(diǎn)和生物素-抗體的聚合體的熒光強(qiáng)度，這樣除以單個的鏈霉親和素-量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，就能知道了量子點(diǎn)結(jié)合了多少抗體。 熒光強(qiáng)度會不會測定？ 不會的話，我告訴你具體方法。因?yàn)楝F(xiàn)在電子書不在我手里，我尚未回家，一會要去聚餐。  還有，我總體上認(rèn)為你的實(shí)驗(yàn)可能走了很大的彎路，我知道量子點(diǎn)的具體用途，你沒有必要即用鏈霉親和素 - 生物素 ，又用抗體，因?yàn)榭贵w本身就可以為量子點(diǎn)在細(xì)胞內(nèi)專一性結(jié)合抗原，而為把量子點(diǎn)帶到特定細(xì)胞內(nèi)位點(diǎn)，如果使細(xì)胞外實(shí)驗(yàn)就更簡單了，要鑒定蛋白質(zhì)或其他生物大分子，不用量子點(diǎn)也可以。你能否說說你的實(shí)驗(yàn)?zāi)康�，可能我可以給你重新設(shè)一下實(shí)驗(yàn)，使你的實(shí)驗(yàn)流程簡單一些。因?yàn)槲揖秃軕�，絕對不愿意繁瑣的實(shí)驗(yàn)操作。 |
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1210808010樓2014-07-10 18:06:12
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