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pushizi木蟲 (小有名氣)
pushizi
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[求助]
示蹤色素覆蓋在蛋白條帶上-western blot結(jié)果很難看-求解決
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最近在進(jìn)行一個約為14 kD大小蛋白的western blot實驗，很郁悶的是：電泳出來后，我的蛋白條帶就在loading buffer的指示劑（考馬斯亮藍(lán)（G250））的藍(lán)色部分區(qū)域，將其轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜后，藍(lán)色的染料也能轉(zhuǎn)到膜上，顯色完條帶就跟藍(lán)色的交雜在一起，非常難看。思考以下解決方案，請大家多提建議，哪條可行： （1）換用膠的濃度：現(xiàn)在用的是15%的膠。是否應(yīng)該換用20%的膠濃度？看一些帖子里好像指示劑的快慢在不同的膠濃度中不同。20%的膠中指示劑的大小在哪里？有沒有蟲友做過�。苛硗�，14kD的蛋白是不是用20%的膠濃度有點夸張��？ （2）將示蹤劑換為溴酚藍(lán)？看一些帖子中有人說溴酚藍(lán)能跑在7 kD的蛋白以下，又有人說在17kD左右，有否確定的說法��？請注下膠濃度~~ （3）能否不加指示劑啊？僅用甘油沉淀蛋白，然后用預(yù)染marker進(jìn)行指示？這個過程有人做過么？會有問題么？另外，甘油的終濃度采用多少比較好啊？ 最后，再請教大家一個問題，在做western blot的過程中，條帶總是溢出，我不確定每個樣品（全細(xì)胞裂解液）中我的目的蛋白有多少，那么我除了反復(fù)試驗，減少上樣量之外，有沒有其他什么快速簡便的方法來解決？ 感謝從頭看到尾的朋友們！更加感謝能夠為我解答的各位好心人！在此先謝過�。� |
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