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小雨莎莎木蟲 (正式寫手)
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[求助]
有沒有做過transwell的前輩？指點一下
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| 最近在做cell migration的實驗，用的是密理博的transwell，8μm的，24孔板適用的那種獨立包裝的小室，因為以前沒做過，所以先做了預實驗，但是做了兩次預實驗都發(fā)現(xiàn)最后用結(jié)晶紫染色后什么都沒有了，是什么狀況呢？實驗后處理流程大概是這樣的：培養(yǎng)結(jié)束后，取出小室，用棉簽擦掉小室內(nèi)的膜上未穿過去的細胞，然后把小室懸掛于24孔板的well里，well里預先加入了0.6mL的4%多聚甲醛，室溫固定10min，然后用PBS稍微清洗殘留的多聚甲醛，包括在小室里的，然后懸掛浸泡在1%的結(jié)晶紫（ddH2O配制），20min，室溫，然后用PBS洗去浮色。然后懸掛在24孔板里鏡檢�；緵]看到細胞，但是因為在本來小室放置的對應的那個well里找到了少量的細胞，很少，個位數(shù)，說明是有穿過去的，但是為啥就是染不出來？難道在處理的時候掉了？哪位蟲友幫忙解答一下？謝謝！ |
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 細胞生物學實驗經(jīng)驗 |
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【答案】應助回帖
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小雨莎莎: 金幣+3, ★★★很有幫助, 謝謝！ 2013-08-13 22:38:52
silicare: 金幣+6, BioEPI+1, 謝謝參與 2013-08-21 17:52:48
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silicare: 金幣+6, BioEPI+1, 謝謝參與 2013-08-21 17:52:48
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個人認為有可能的原因如下： 第一：細胞培養(yǎng)的時間很重要，也很難掌握，這個就看你自己對所培養(yǎng)細胞生長特性的了解程度了。長得久了穿出來的會太多，長的時間少了，穿出來會太少。像你這種情況有可能屬于上述第二種，而且你找到了下室有細胞，不一定就代表穿出來了，因為如果穿出來太少，自然有可能脫落。我個人認為，掌握好細胞在小室中的培養(yǎng)時間長度是實驗成功與否最關(guān)鍵的影響因素。為了這步能成功，建議鋪細胞的時候多鋪幾個孔，然后培養(yǎng)相同長度的時間，只要你鋪的孔夠多，總會有那么幾個孔在預計的時間內(nèi)穿出令你滿意的細胞術(shù)（當然，這樣做是建立在經(jīng)濟基礎(chǔ)上的），預實驗也可以這樣摸條件。 第二、建議取出小室后先4%多聚甲醛固定（可固定10-15分鐘），然后再染色（0.5%的結(jié)晶紫15分鐘為宜），最后再用棉簽擦。先用極小流量的自來水沖洗小室柱子外側(cè)，切記不要沖到小室底部，但是得沖過柱子側(cè)面的水流過底面，后用棉簽擦內(nèi)室面，晾干、拍照。 第三、小室鋪細胞的時候一定要均勻。要不然肯定是沒細胞可穿了，大家都會集中在最中間，穿過去的也會脫落。 |
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小雨莎莎
2樓2013-08-13 19:39:10
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10樓2013-08-16 10:52:38
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