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lesirenuse新蟲 (初入文壇)
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[求助]
gateway BP反應(yīng)涂板沒有菌長(zhǎng)出來(lái) 已有1人參與
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最近在做gateway，有一個(gè)入門載體已經(jīng)測(cè)序正確了。之后LR反應(yīng)，涂板后有兩個(gè)單克隆，都是假陽(yáng)性的。之后再涂板，就沒有菌長(zhǎng)出來(lái)了。 另外兩個(gè)BP反應(yīng)后涂板，也沒有菌長(zhǎng)出來(lái)。片段都在2k以下。確定抗性沒有弄錯(cuò) 求大神相助，折騰了一周了。 |
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starseacow
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silicare: 金幣+2, 應(yīng)助指數(shù)+1, 謝謝分享 2013-10-21 08:22:36
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http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=4409532 見我發(fā)的資料，其中兩個(gè)是gateway的說(shuō)明書 |
8樓2013-10-20 01:11:54
starseacow
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
137167741: 金幣+1, 小木蟲交流，共同進(jìn)步~~ 2013-10-20 02:56:22
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| entry clone在做LR反應(yīng)前最好進(jìn)行PEG純化，否則反應(yīng)效率太低。正常LR反應(yīng)應(yīng)保證EC和vector都在100 ng以上，一切順利，估計(jì)可以長(zhǎng)出成百上千個(gè)菌落。 |
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lesirenuse2樓2013-08-22 21:19:31
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lesirenuse(silicare代發(fā)): 金幣+5, 謝謝參與 2013-10-21 08:21:55
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lesirenuse(silicare代發(fā)): 金幣+5, 謝謝參與 2013-10-21 08:21:55
| 沒那么玄乎哈，我們做BP的時(shí)候直接將PCR加入到反應(yīng)體系中都能出來(lái)，LR的時(shí)候直接用kit提取的載體，就能搞定，而且我們每個(gè)反應(yīng)都是只加1微升的酶。根據(jù)我的經(jīng)驗(yàn)，做gateway的時(shí)候關(guān)鍵是濃度問題，尤其是PCR產(chǎn)物or pZEO，可以低點(diǎn)，但千萬(wàn)別高，Good luck！ |
4樓2013-08-23 22:27:11
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6樓2013-09-04 09:34:27
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太感謝了。 7樓2013-10-19 23:12:08
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