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xls8678759鐵蟲 (小有名氣)
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[求助]
關(guān)于小鼠骨髓間充質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)鑒定 已有1人參與
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1.4 供體小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及培養(yǎng) ① B/L小鼠雄性4周齡頸部脫臼處死，在 75%酒精浸泡 10 min。②放置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)移入超凈工作臺(tái)，無菌條件下取其雙側(cè)股骨與脛骨，在裝有DMEM/F12 的培養(yǎng)皿內(nèi)將骨表面附有的肌肉及肌筋膜等剔除干凈，兩端剪斷暴露骨髓腔。③ 5ml注射器穿刺干骺端，用 DMEM/F12培養(yǎng)基沖洗骨髓腔直至沖出液清亮為止，收集沖洗下來的骨髓細(xì)胞懸液于無菌離心管中，充分吹打混勻后制成單細(xì)胞懸液。1000 r /min 離心5 min，棄上清，以含 10 %胎牛血清的DMEM/F12 完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種至6cm塑料培養(yǎng)皿，置于37 ℃、5 % CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48h 后，棄除懸浮細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，2－3d 換液1 次，至貼壁細(xì)胞80%-90%融合后（大概1周），以含0.01%EDTA 的0.25％胰蛋白酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。 1.5 MSC的傳代培養(yǎng)及細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 每日在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和貼壁情況。 原代細(xì)胞生長達(dá)80%~90%時(shí)，吸凈培養(yǎng)瓶中的液體， PBS洗滌 2次，取 37℃預(yù)熱過的 0.25 %胰酶 1mL，于 37℃恒溫消化 2min。鏡下觀察細(xì)胞見細(xì)胞從梭形變?yōu)閳A形，以 10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)基終止消化，吹打細(xì)胞，使細(xì)胞完全從培養(yǎng)瓶中脫落并吹打成單細(xì)胞懸液。吸取細(xì)胞懸液至 15 mL的離心管中， 1 000 r/min離心 5 min，移去上清，見離心管底部一層白色沉淀，加入 DMEM/F12培養(yǎng)液，制成單細(xì)胞懸液。原代細(xì)胞按 1:2比例傳代培養(yǎng)。 問題：細(xì)胞已傳至第二代（培養(yǎng)時(shí)間10天）， 但發(fā)現(xiàn)生長緩慢，不知道是什么原因?qū)е隆?br /> 而且 那細(xì)胞形態(tài)不知道是不是MSC呀，有老師說大部分都不是MSC。我頓覺悲催呀~~有沒蟲友能告訴我哪些是MSC呀 001003.png |
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sibaishou
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2樓2014-05-12 14:12:13
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