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[求助]
TA克隆求助
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本人前面做TA克隆，將PCR產(chǎn)物（1000bp多點(diǎn)）切膠回收后連接pMD19-T simple載體（體系：載體1uL，PCR產(chǎn)物4uL，Solution I 5uL），16 ℃連接1h（說明書要求30min），先后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)（鼎國）和Top10（天根），涂氨芐平板，都不長菌落。 請(qǐng)各位蟲友幫忙分析一下，感激不盡！ |
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樓主你好 曾經(jīng)我也遇到這樣的問題 現(xiàn)在基本上不會(huì)了 我的解決辦法如下： 1、你的連接體系沒有問題 我的大小也是和你的差不多大 也是這么連接的，我不是16℃連接1小時(shí)，你可以試試4℃過夜連接試試，我比較過二者的差異性，后者的效果很好，我一開始是16℃連接長的不多或者很少，但是改用4℃過夜連接，每次都會(huì)長出來，且轉(zhuǎn)化子很多； 2、你的感受態(tài)很可能有問題，你可以自己試試做下感受態(tài)，感受態(tài)在制作和使用的過程中必須要全程冰浴，如果你沒有全程冰浴，很可能轉(zhuǎn)化效率就會(huì)很低，基本上沒有轉(zhuǎn)化子。 最后你試試吧，如果還有問題 可以聯(lián)系我啊 希望你順利解決問題! |
11樓2013-08-26 14:26:31
yujitianqing
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14樓2013-08-26 18:55:20
guxinhan123
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2樓2013-08-25 21:11:05
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3樓2013-08-25 22:04:26
cicelyzh
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4樓2013-08-25 23:21:55
yujitianqing
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個(gè)人覺得購買的感受態(tài)、連接載體試劑盒不會(huì)有問題。 載體和PCR產(chǎn)物比例有沒問題？ PCR產(chǎn)物末端是否有游離的A？ 轉(zhuǎn)化步驟是否有問題?經(jīng)過熱激嗎？轉(zhuǎn)化過程中加培養(yǎng)基恢復(fù)抗氨芐的培養(yǎng)基最好是SOC。 氨芐濃度做好不要太高，50ng/ml就可以了。 |
5樓2013-08-26 09:02:01
jacky1985310
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6樓2013-08-26 10:52:54
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前面的蟲友都講了pcr產(chǎn)物加A和質(zhì)量之類的問題了 我曾經(jīng)比較過，pMD18-T連接30min或1h的效率其實(shí)是比較低的，估計(jì)這個(gè)pMD19可能也是差不多。如果可以的話，連接過夜，或者22℃連接2h，效果會(huì)好很多。 其實(shí)如果在PCR產(chǎn)物正常加A，產(chǎn)物質(zhì)量也高，感受態(tài)也好，轉(zhuǎn)化步驟也正常的情況下，就算連接不徹底，轉(zhuǎn)化也不會(huì)有太大問題。但問題就是你得確保上述都很好。 |
7樓2013-08-26 11:14:07
8樓2013-08-26 14:14:03
9樓2013-08-26 14:14:35
10樓2013-08-26 14:15:45
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