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[求助]
TA克隆求助
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本人前面做TA克隆，將PCR產(chǎn)物（1000bp多點）切膠回收后連接pMD19-T simple載體（體系：載體1uL，PCR產(chǎn)物4uL，Solution I 5uL），16 ℃連接1h（說明書要求30min），先后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)（鼎國）和Top10（天根），涂氨芐平板，都不長菌落。 請各位蟲友幫忙分析一下，感激不盡！ |
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14樓2013-08-26 18:55:20
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4樓2013-08-25 23:21:55
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個人覺得購買的感受態(tài)、連接載體試劑盒不會有問題。 載體和PCR產(chǎn)物比例有沒問題？ PCR產(chǎn)物末端是否有游離的A？ 轉(zhuǎn)化步驟是否有問題?經(jīng)過熱激嗎？轉(zhuǎn)化過程中加培養(yǎng)基恢復(fù)抗氨芐的培養(yǎng)基最好是SOC。 氨芐濃度做好不要太高，50ng/ml就可以了。 |
5樓2013-08-26 09:02:01
jacky1985310
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【答案】應(yīng)助回帖
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前面的蟲友都講了pcr產(chǎn)物加A和質(zhì)量之類的問題了 我曾經(jīng)比較過，pMD18-T連接30min或1h的效率其實是比較低的，估計這個pMD19可能也是差不多。如果可以的話，連接過夜，或者22℃連接2h，效果會好很多。 其實如果在PCR產(chǎn)物正常加A，產(chǎn)物質(zhì)量也高，感受態(tài)也好，轉(zhuǎn)化步驟也正常的情況下，就算連接不徹底，轉(zhuǎn)化也不會有太大問題。但問題就是你得確保上述都很好。 |
7樓2013-08-26 11:14:07
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