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求確認(rèn)雙內(nèi)切酶體系
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TAKARA的Hind III 和EcoR I 酶，目的基因在1000bp左右，連接在2736bp的T-Vector上，PCDNA在3000多bp左右，現(xiàn)用兩個限制性內(nèi)切酶對T質(zhì)粒和PCDNA進(jìn)行酶切，T質(zhì)粒的濃度在5.5ng/ul,PCDNA的濃度在0.8ng/ul,準(zhǔn)備的酶切體系如下： T質(zhì)粒 稀釋5倍后取1ul 10*M buffer 2ul Hind III 1ul EcoR I 1ul h2o 15ul total 20ul 37° 過夜 PCDNA 1ul 10*M buffer 2ul Hind III 1ul EcoR I 1ul h2o 15ul total 20ul 37° 過夜 求大神指導(dǎo)修改體系，還有幾個小問題： 過夜反應(yīng)是否必要？2小時酶切可以嗎？ 如果想要多回收DNA，加大上樣量，把體系改成40ul可以嗎？ 據(jù)說酶切好后，純化電泳時做的膠不能加EB，要在跑完電泳后放在EB中泡10MIN，不然會影響后面的連接，是這樣嗎？ |
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ninjakiss
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| 體系本身沒有什么意見；每一種酶的活力均不一致，具體的還是參照說明書來看看（不過我至少還是切3小時的，不是迫不得已不會過夜，怕影響結(jié)果）；加大上樣量是可以的，但是請在配制體系時注意混勻，如果覺得單獨(dú)一個管中體系過大，你可以將它們多分裝一些，到時候加樣的時候組合起來加也可以的（一般膠回收我們習(xí)慣是50的體系點(diǎn)一個大孔，不是40的），還有就是點(diǎn)樣的時候盡可能在一個孔中多加一些，而不是增加孔數(shù)，這是為了增加你的條帶亮度；染膠還有掃膠、切膠的時候一定要盡快完成，防止目的片段發(fā)生改變。當(dāng)然，少染一會條帶可能會有些暗，其實(shí)只要是大小正確，趕快切就好了。至于你是在膠里加EB還是跑完以后再染EB，這本身沒有什么分別（我都試過，沒什么問題）。 |
2樓2013-08-29 16:53:48
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說明書上的活性確認(rèn)：在50ul反應(yīng)液中，37°溫度下反應(yīng)1小時，將1ug的DNA完全分解的酶量定義為1個活性單位U。一般反應(yīng)體系： EcoR I 1ul 10*buffer 2ul DNA ≤1ug h2o up to 20 ul 50ul的全部加在1.75mm的孔？有一次加40ul都會溢出來。。。50ul體系的話這樣可以嗎？ T質(zhì)粒 稀釋5倍后取2ul 10*M buffer 5ul Hind III 2ul EcoR I 2ul h2o 39ul total 50ul 37° 過夜 PCDNA 2ul 10*M buffer 5ul Hind III 2ul EcoR I 2ul h2o 39ul total 50ul 37° 過夜 |
3樓2013-08-29 17:09:33
ninjakiss
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gyesang: 金幣+2, 鼓勵回帖交流！ 2013-08-29 21:19:32
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說明書說1小時，那么就可以按照1小時來操作。制膠的梳子我們這里有三種規(guī)格，你說的1.75的可能是最小的那一種，我試過用這一種加15，那么我常常酶切30，點(diǎn)滿滿兩個孔。我說的50的膠槽一橫排就只有13的大孔，點(diǎn)50無壓力的。如果你那邊只有小孔梳子的話，你也可以多制備一些體系，大不了多點(diǎn)幾個孔就是了。不過還是盡可能加大每一孔的樣品量，讓它們變得亮一些，你好在沒染夠的前提下也能發(fā)現(xiàn)你的目的條帶。 |
4樓2013-08-29 17:15:27
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| 加大反應(yīng)體系到40ul，把你的各個反應(yīng)液同比例擴(kuò)大2被就行了。你的模版量太少了，我們提出質(zhì)粒500ng/ul 都要切2-3ul。酶切不是說時間越長越好，建議考慮5小時，太長容易吧載體切碎，太多切不開。 |
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sars378樓2013-08-30 10:08:31
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