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lizhijiang木蟲 (著名寫手)
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[交流]
高質量DNA獲取方法之月桂酸鈉法（轉） 已有6人參與
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科學網http://blog.sciencenet.cn/blog-657244-721856.html 高質量DNA獲取方法之月桂酸鈉法 徐大彬 從組織中獲取DNA難嗎？不難，真不難。高一就有開設的從雞血中獲取DNA的生物實驗課，很簡單的幾步就可以得到DNA。但要想獲取高質量的DNA，尤其是從一些富含多糖、多酚、淀粉、纖維和蛋白的組織，后面用于酶切、高通量測序大片段文庫的構建,還是有一定的難度的。 最近協(xié)助北京農業(yè)生物技術研究中心一個老師提取桃葉片DNA還是遇到了一些困難，因為老師要做桃的個體重測序，因此對DNA的要求還是非常高的。之前跟其他很多老師交流植物DNA的提取，大多數(shù)目前仍然使用CTAB法，有些老師購買試劑盒進行提取，其實很多植物DNA提取試劑盒成分也是CTAB。CTAB法是提取植物DNA非常經典方法，但在提取的過程中由于要在65℃水浴中放置1個小時，因此耗時較長。我們在使用該法提取桃DNA時，獲得DNA中含有大量的蛋白和多糖，雖然通過多次的苯酚氯仿抽提可以大部分去除，但DNA得率較低。在這里給大家分享一種快速獲取植物高質量DNA的方法，供大家在提取植物DNA時作為參考，用該法提取的植物DNA完全滿足后續(xù)酶切、BAC文庫構建、高通量測序大片段文庫構建，將該法稱之為月桂酸鈉法。 月桂酸鈉抽提緩沖液： Tris-Hcl（pH8.0）100mmol/L；NaCl 100mmol/L；EDTA（pH8.0）20mmol/L；月桂酸鈉 1%； 配法：準確稱取NaCl 5.844g，月桂酸鈉 10g置于1000mL燒杯中，加入100ml Tris-Hcl（1M）以及40mLEDTA（0.5M）、800mlddH2O，用鹽酸調節(jié)pH至8.0，定容至10000mL，滅菌后室溫保存。 月桂酸鈉英文名稱：sodium lauroyl sarcosine 分子式：C15H28NaO3N，分子量：293.39。 以該法大量獲取玉米葉片DNA為例的實驗流程： （1）選取適量的玉米幼苗新鮮葉片，以紗布捆扎，做好標記，置于液氮中保存； （2）研缽以液氮預冷，將玉米葉片置于研缽中，倒入液氮，迅速研磨至粉末級，期間時時加入液氮，防止研磨過程中DNA被降解； （3）將研磨好的粉末移入滅菌后的50mL抽提試管中，用移液管加入10mL月桂酸鈉抽提緩沖液，反復緩慢的搖勻； （4）用移液管向50mL抽提試管中加入等體積（10mL）酚：氯仿：異戊醇（25:24:1），反復緩慢的搖勻； （5）12000 rpm，4°C離心20min后取出，小心吸取上清液16mL于新滅菌的50ml抽提試管中； （6）向上述抽提試管中加入12mL異丙醇，上下緩慢顛倒數(shù)次，有白色絮狀沉淀析出，顛倒時注意往一個方向，防止沉淀散開，不利于后續(xù)實驗； （7）將白色絮狀沉淀用槍頭從抽提試管中輕輕挑出，至于2mL EP管中； （8）向上述2mL EP管中加入1.8mL70%乙醇，反復輕輕震蕩洗滌，4°C，12000 rpm，高速離心15min，棄上清，重復此步驟兩次； （9）將得到的白色沉淀再次4°C，12000 rpm短暫離心數(shù)秒，以移液器吸干殘留乙醇； （10）白色沉淀置于37°C干燥箱中，使殘存的70%乙醇全部揮發(fā)干凈，這個過程中要經常拿出觀察，防止過度烘干，不利于后面溶解； （11）待白色沉淀變透明后，向2mLEP管中加入0.9mLTE緩沖液（pH8.0），放置于65℃恒溫箱中，期間輕微彈勻，使DNA充分溶解； （12）DNA完全溶解后，加入5μL RNase(0.1mg/mL)，置于37°C干燥箱中30min，消化RNA，取出3μL，以1%瓊脂糖膠檢測是否有RNA殘留； （13）待RNA消化完成后，向EP管中加入等體積（0.9mL）氯仿，輕輕搖勻； （14）4°C，12000 rpm高速離心15min； （15）吸取0.7mL上清置于1.5ml新EP管中，加入1/10體積(約0.07mL)NaAc(3M/L)溶液，輕輕搖勻； （16）向上述EP管中加入等體積（0.7mL）異丙醇，輕輕搖勻后，于-20°C靜置20min； （17）4°C，12000 rpm高速離心15min，棄上清； （18）將得到的白色沉淀以70%乙醇洗滌兩次，去除殘留的乙醇； （19）白色沉淀置于37°C干燥箱中，使殘存的70%乙醇全部揮發(fā)干凈，該過程中要經常拿出觀察，防止烘干過度，不利于后面溶解； （20）待白色沉淀變透明，管中無殘留的乙醇味后，加入200μL TE（pH8.0），于37°C干燥箱中溶解； （21）待DNA完全溶解后，取出1μL，以分光光度計測定OD值，分裝后于保存（-20°C）。 以該法獲取的玉米葉片DNA電泳圖如下： DNA提取過程中常見問題及建議解決方案： 常見問題 可能原因 建議解決方案 洗脫產物的DNA量很少或沒有 所提樣品材料老化或反復凍融導致基因組DNA含量下降 應選擇新鮮的樣品材料，如新鮮血液、新鮮菌液、剛離體的動物組織或幼嫩的植物組織等，不能即時處理的樣品應立即放入液氮或-70℃低溫保存，以免DNA降解。 樣品破壁或裂解不完全導致基因組DNA未充分釋放 動、植物材料應在液氮中充分研磨勻漿，G+細菌、酵母等破壁較困難的樣品應用溶菌酶、酵母破壁酶或機械方式協(xié)助破壁，不同樣品的細胞破壁方式可參照前面的詳細介紹。 樣品量過多導致細胞裂解不充分 加樣量過多使裂解液和樣品混合不均勻，細胞裂解不充分。不同來源樣品的加樣量請參照詳細操作步驟。 DNA吸附不充分 如在上吸附柱前末加無水乙醇，或用低濃度乙醇代替無水乙醇，則導致DNA不能充分沉淀，與硅膠膜吸附不徹底，因此應在樣品裂解后加適量無水乙醇，再上吸附柱使DNA與硅膠膜充分吸附。 DNA洗脫不適當 洗脫液pH值過低會降低洗脫效率，應確保洗脫液pH值在7.0-8.5之間；洗脫體積若小于30μ，則不易完全浸透硅膠膜，使DNA不能全部洗脫下來，因此洗脫液體積應大于30 μl，同時如洗脫液體積過大，超過200μl，則所得的DNA濃度會降低，但DNA總量不會減少；洗脫時可將洗脫緩沖液在65-70℃水浴預熱，加入洗脫液后在室溫靜置2-5分鐘，可提高洗脫效率，提高基因組DNA的產量。 提取的基因組DNA有降解 選取的材料不新鮮或反復凍融，采集材料后未及時處理或末低溫保存 陳舊血液、老化菌液等不新鮮的材料中，細胞凋亡導致DNA降解，或低溫保存的樣品反復凍融導致細胞破碎，內源核酸酶降解DNA，因此應選擇新鮮的材料樣品，不能及時處理則低溫保存，運輸過程中亦應使用干冰。 未能有效抑制內源核酸酶作用 某些DNase含量較豐富的動、植物組織樣品應在液氮中研磨或勻漿，研磨過程中應隨時補充液氮，并在樣品末完全解凍前即加入含有抑制核酸酶作用的鰲合劑的裂解液。 操作過于劇烈導致DNA被機打斷 預處理的樣品加入細胞裂解液后，所有操作應盡量柔和，避免振蕩、攪拌等劇烈機械力對DNA片段的損傷。 提取的基因組DNA中有RNA污染 實驗過程中沒有有效使用RNase A 應嚴格按照實驗操作要求使用，即加入裂解液的同時加入20μl RNase A溶液，室溫放置10分鐘。 RNAase A可能失活 RNase A須在-20℃下保存，低溫保存時RNase A比較穩(wěn)定，不易失活，但如果反復凍融會導致RNase A降解失活，所以應妥善保存。 提取的基因組DNA不能順利地進行后續(xù)試驗 樣品量過多導致細胞裂解不充分 樣品量過多會使裂解液不能快速有效地與樣品充分混合，從而導致樣品裂解不徹底，殘留大量蛋自、多糖、脂類等雜質，為后續(xù)的上吸附柱分離純化造成影響。應加入適當量的樣品材料，具體數(shù)量請參照詳細操作步驟。 DNA在洗脫前有大量乙醇殘留 有機溶劑乙醇可嚴重抑制內切酶、DNA聚合酶的活性，而在DNA過柱洗滌過程中需使用含有乙醇的漂洗液，因此在洗脫DNA前，—定要充分去除殘留的乙醇，可重復離心，或將吸附柱置于室溫或50℃溫箱中烘干5-10分鐘，再加洗脫液。 來源：http://www.chem17.com/st151778/Article_105896.html 致謝！ |
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 生物技術/方法講解 | 基因 | 分子分子 | 實驗 |
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