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lizhijiang木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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高質(zhì)量DNA獲取方法之月桂酸鈉法（轉(zhuǎn)） 已有6人參與
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科學(xué)網(wǎng)http://blog.sciencenet.cn/blog-657244-721856.html 高質(zhì)量DNA獲取方法之月桂酸鈉法 徐大彬 從組織中獲取DNA難嗎？不難，真不難。高一就有開(kāi)設(shè)的從雞血中獲取DNA的生物實(shí)驗(yàn)課，很簡(jiǎn)單的幾步就可以得到DNA。但要想獲取高質(zhì)量的DNA，尤其是從一些富含多糖、多酚、淀粉、纖維和蛋白的組織，后面用于酶切、高通量測(cè)序大片段文庫(kù)的構(gòu)建,還是有一定的難度的。 最近協(xié)助北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心一個(gè)老師提取桃葉片DNA還是遇到了一些困難，因?yàn)槔蠋熞鎏业膫�(gè)體重測(cè)序，因此對(duì)DNA的要求還是非常高的。之前跟其他很多老師交流植物DNA的提取，大多數(shù)目前仍然使用CTAB法，有些老師購(gòu)買(mǎi)試劑盒進(jìn)行提取，其實(shí)很多植物DNA提取試劑盒成分也是CTAB。CTAB法是提取植物DNA非常經(jīng)典方法，但在提取的過(guò)程中由于要在65℃水浴中放置1個(gè)小時(shí)，因此耗時(shí)較長(zhǎng)。我們?cè)谑褂迷摲ㄌ崛√褼NA時(shí)，獲得DNA中含有大量的蛋白和多糖，雖然通過(guò)多次的苯酚氯仿抽提可以大部分去除，但DNA得率較低。在這里給大家分享一種快速獲取植物高質(zhì)量DNA的方法，供大家在提取植物DNA時(shí)作為參考，用該法提取的植物DNA完全滿足后續(xù)酶切、BAC文庫(kù)構(gòu)建、高通量測(cè)序大片段文庫(kù)構(gòu)建，將該法稱之為月桂酸鈉法。 月桂酸鈉抽提緩沖液： Tris-Hcl（pH8.0）100mmol/L；NaCl 100mmol/L；EDTA（pH8.0）20mmol/L；月桂酸鈉 1%； 配法：準(zhǔn)確稱取NaCl 5.844g，月桂酸鈉 10g置于1000mL燒杯中，加入100ml Tris-Hcl（1M）以及40mLEDTA（0.5M）、800mlddH2O，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0，定容至10000mL，滅菌后室溫保存。 月桂酸鈉英文名稱：sodium lauroyl sarcosine 分子式：C15H28NaO3N，分子量：293.39。 以該法大量獲取玉米葉片DNA為例的實(shí)驗(yàn)流程： （1）選取適量的玉米幼苗新鮮葉片，以紗布捆扎，做好標(biāo)記，置于液氮中保存； （2）研缽以液氮預(yù)冷，將玉米葉片置于研缽中，倒入液氮，迅速研磨至粉末級(jí)，期間時(shí)時(shí)加入液氮，防止研磨過(guò)程中DNA被降解； （3）將研磨好的粉末移入滅菌后的50mL抽提試管中，用移液管加入10mL月桂酸鈉抽提緩沖液，反復(fù)緩慢的搖勻； （4）用移液管向50mL抽提試管中加入等體積（10mL）酚：氯仿：異戊醇（25:24:1），反復(fù)緩慢的搖勻； （5）12000 rpm，4°C離心20min后取出，小心吸取上清液16mL于新滅菌的50ml抽提試管中； （6）向上述抽提試管中加入12mL異丙醇，上下緩慢顛倒數(shù)次，有白色絮狀沉淀析出，顛倒時(shí)注意往一個(gè)方向，防止沉淀散開(kāi)，不利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)； （7）將白色絮狀沉淀用槍頭從抽提試管中輕輕挑出，至于2mL EP管中； （8）向上述2mL EP管中加入1.8mL70%乙醇，反復(fù)輕輕震蕩洗滌，4°C，12000 rpm，高速離心15min，棄上清，重復(fù)此步驟兩次； （9）將得到的白色沉淀再次4°C，12000 rpm短暫離心數(shù)秒，以移液器吸干殘留乙醇； （10）白色沉淀置于37°C干燥箱中，使殘存的70%乙醇全部揮發(fā)干凈，這個(gè)過(guò)程中要經(jīng)常拿出觀察，防止過(guò)度烘干，不利于后面溶解； （11）待白色沉淀變透明后，向2mLEP管中加入0.9mLTE緩沖液（pH8.0），放置于65℃恒溫箱中，期間輕微彈勻，使DNA充分溶解； （12）DNA完全溶解后，加入5μL RNase(0.1mg/mL)，置于37°C干燥箱中30min，消化RNA，取出3μL，以1%瓊脂糖膠檢測(cè)是否有RNA殘留； （13）待RNA消化完成后，向EP管中加入等體積（0.9mL）氯仿，輕輕搖勻； （14）4°C，12000 rpm高速離心15min； （15）吸取0.7mL上清置于1.5ml新EP管中，加入1/10體積(約0.07mL)NaAc(3M/L)溶液，輕輕搖勻； （16）向上述EP管中加入等體積（0.7mL）異丙醇，輕輕搖勻后，于-20°C靜置20min； （17）4°C，12000 rpm高速離心15min，棄上清； （18）將得到的白色沉淀以70%乙醇洗滌兩次，去除殘留的乙醇； （19）白色沉淀置于37°C干燥箱中，使殘存的70%乙醇全部揮發(fā)干凈，該過(guò)程中要經(jīng)常拿出觀察，防止烘干過(guò)度，不利于后面溶解； （20）待白色沉淀變透明，管中無(wú)殘留的乙醇味后，加入200μL TE（pH8.0），于37°C干燥箱中溶解； （21）待DNA完全溶解后，取出1μL，以分光光度計(jì)測(cè)定OD值，分裝后于保存（-20°C）。 以該法獲取的玉米葉片DNA電泳圖如下： DNA提取過(guò)程中常見(jiàn)問(wèn)題及建議解決方案： 常見(jiàn)問(wèn)題 可能原因 建議解決方案 洗脫產(chǎn)物的DNA量很少或沒(méi)有 所提樣品材料老化或反復(fù)凍融導(dǎo)致基因組DNA含量下降 應(yīng)選擇新鮮的樣品材料，如新鮮血液、新鮮菌液、剛離體的動(dòng)物組織或幼嫩的植物組織等，不能即時(shí)處理的樣品應(yīng)立即放入液氮或-70℃低溫保存，以免DNA降解。 樣品破壁或裂解不完全導(dǎo)致基因組DNA未充分釋放 動(dòng)、植物材料應(yīng)在液氮中充分研磨勻漿，G+細(xì)菌、酵母等破壁較困難的樣品應(yīng)用溶菌酶、酵母破壁酶或機(jī)械方式協(xié)助破壁，不同樣品的細(xì)胞破壁方式可參照前面的詳細(xì)介紹。 樣品量過(guò)多導(dǎo)致細(xì)胞裂解不充分 加樣量過(guò)多使裂解液和樣品混合不均勻，細(xì)胞裂解不充分。不同來(lái)源樣品的加樣量請(qǐng)參照詳細(xì)操作步驟。 DNA吸附不充分 如在上吸附柱前末加無(wú)水乙醇，或用低濃度乙醇代替無(wú)水乙醇，則導(dǎo)致DNA不能充分沉淀，與硅膠膜吸附不徹底，因此應(yīng)在樣品裂解后加適量無(wú)水乙醇，再上吸附柱使DNA與硅膠膜充分吸附。 DNA洗脫不適當(dāng) 洗脫液pH值過(guò)低會(huì)降低洗脫效率，應(yīng)確保洗脫液pH值在7.0-8.5之間；洗脫體積若小于30μ，則不易完全浸透硅膠膜，使DNA不能全部洗脫下來(lái)，因此洗脫液體積應(yīng)大于30 μl，同時(shí)如洗脫液體積過(guò)大，超過(guò)200μl，則所得的DNA濃度會(huì)降低，但DNA總量不會(huì)減少；洗脫時(shí)可將洗脫緩沖液在65-70℃水浴預(yù)熱，加入洗脫液后在室溫靜置2-5分鐘，可提高洗脫效率，提高基因組DNA的產(chǎn)量。 提取的基因組DNA有降解 選取的材料不新鮮或反復(fù)凍融，采集材料后未及時(shí)處理或末低溫保存 陳舊血液、老化菌液等不新鮮的材料中，細(xì)胞凋亡導(dǎo)致DNA降解，或低溫保存的樣品反復(fù)凍融導(dǎo)致細(xì)胞破碎，內(nèi)源核酸酶降解DNA，因此應(yīng)選擇新鮮的材料樣品，不能及時(shí)處理則低溫保存，運(yùn)輸過(guò)程中亦應(yīng)使用干冰。 未能有效抑制內(nèi)源核酸酶作用 某些DNase含量較豐富的動(dòng)、植物組織樣品應(yīng)在液氮中研磨或勻漿，研磨過(guò)程中應(yīng)隨時(shí)補(bǔ)充液氮，并在樣品末完全解凍前即加入含有抑制核酸酶作用的鰲合劑的裂解液。 操作過(guò)于劇烈導(dǎo)致DNA被機(jī)打斷 預(yù)處理的樣品加入細(xì)胞裂解液后，所有操作應(yīng)盡量柔和，避免振蕩、攪拌等劇烈機(jī)械力對(duì)DNA片段的損傷。 提取的基因組DNA中有RNA污染 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有有效使用RNase A 應(yīng)嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)操作要求使用，即加入裂解液的同時(shí)加入20μl RNase A溶液，室溫放置10分鐘。 RNAase A可能失活 RNase A須在-20℃下保存，低溫保存時(shí)RNase A比較穩(wěn)定，不易失活，但如果反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致RNase A降解失活，所以應(yīng)妥善保存。 提取的基因組DNA不能順利地進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn) 樣品量過(guò)多導(dǎo)致細(xì)胞裂解不充分 樣品量過(guò)多會(huì)使裂解液不能快速有效地與樣品充分混合，從而導(dǎo)致樣品裂解不徹底，殘留大量蛋自、多糖、脂類(lèi)等雜質(zhì)，為后續(xù)的上吸附柱分離純化造成影響。應(yīng)加入適當(dāng)量的樣品材料，具體數(shù)量請(qǐng)參照詳細(xì)操作步驟。 DNA在洗脫前有大量乙醇?xì)埩?br /> 有機(jī)溶劑乙醇可嚴(yán)重抑制內(nèi)切酶、DNA聚合酶的活性，而在DNA過(guò)柱洗滌過(guò)程中需使用含有乙醇的漂洗液，因此在洗脫DNA前，—定要充分去除殘留的乙醇，可重復(fù)離心，或?qū)⑽街糜谑覝鼗?0℃溫箱中烘干5-10分鐘，再加洗脫液。 來(lái)源：http://www.chem17.com/st151778/Article_105896.html 致謝！ |
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