風(fēng)吹我已散

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[交流] 試劑盒提質(zhì)粒？？？？

最近用QIGEN試劑盒提大腸桿菌中的質(zhì)粒，提出來濃度好低啊，才80ng/u；自己又用手提法提，結(jié)果很好。但是粗提的質(zhì)粒用來轉(zhuǎn)化肯定不好。用試劑盒提了3次了，濃度都很低啊，到底是什么問題呢？

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1樓 2013-09-04 20:34:16

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ykluuniu

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風(fēng)吹我已散: 金幣+2 2013-09-05 08:48:06

除了操作手法不行之外，應(yīng)該沒別的問題。能否詳細(xì)說說你操作的具體過程？

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2樓2013-09-04 23:32:15

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piaoyunokok

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最后一步的時(shí)候躲在小柱上吸附一段時(shí)間

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3樓2013-09-04 23:34:48

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我們用的axgen還不錯(cuò)。有可能產(chǎn)品批次的問題。溶解的時(shí)候加水多溶解會(huì)兒。

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4樓2013-09-05 00:10:24

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2樓: Originally posted by ykluuniu at 2013-09-04 23:32:15
除了操作手法不行之外，應(yīng)該沒別的問題。能否詳細(xì)說說你操作的具體過程？

質(zhì)粒大�。�8K左右；都是按試劑盒上的步驟�。�
1. 50ml過夜菌液離心5000rpm 10分鐘
2. 將沉淀重懸于4ml Buffer P1
3. 加4ml Buffer P2，上下顛倒4~6次，在室溫靜置5min
4.加在4度冰箱放置的Buffer P3，輕輕混勻至藍(lán)色變?yōu)榘咨诒响o置15min
5.12000 rpm, 4度下離心30min
6.QIAGEN-tip 平衡，加4ml BufferQBT
7.吸取步驟5中的上清于BufferQBT中吸附
8.用10ml 的BufferQC 沖洗QIAGEN-tip柱子兩遍（2*10ml)
9.取一只新的管子，用5ml BufferQF沖洗柱子
10.在管中加入3.5ml 的異丙醇來沉淀DNA,混勻后分裝成幾個(gè)小管（約6個(gè)1.5ml），4度放置 30min，之后4度下離心20min,輕輕倒掉液體。
11. 用75%的乙醇（2ml)沖洗DNA, 輕輕上下顛倒，12000 rpm 離心10min，輕輕倒掉液體。
12. 在室溫下靜置5-10min,用dd水溶解DNA.
在10步之后應(yīng)該看到有白色的DNA啊，可是我的看不到。

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5樓2013-09-05 08:47:57

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sxxuan

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qiagen的試劑盒這么麻煩嗎？好像和我的步驟不一樣呢，麻煩這么多的

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6樓2013-09-05 11:54:11

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loveskyzhou

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用了多少菌液呢？

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7樓2013-09-05 12:37:44

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7樓: Originally posted by loveskyzhou at 2013-09-05 12:37:44
用了多少菌液呢？

50ml

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8樓2013-09-05 14:52:41

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6樓: Originally posted by sxxuan at 2013-09-05 11:54:11
qiagen的試劑盒這么麻煩嗎？好像和我的步驟不一樣呢，麻煩這么多的

你用的也是這個(gè)試劑盒么，你的步驟是怎樣的啊？

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9樓2013-09-05 15:12:42

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ykluuniu

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5樓: Originally posted by 風(fēng)吹我已散 at 2013-09-05 08:47:57
質(zhì)粒大�。�8K左右；都是按試劑盒上的步驟�。�
1. 50ml過夜菌液離心5000rpm 10分鐘
2. 將沉淀重懸于4ml Buffer P1
3. 加4ml Buffer P2，上下顛倒4~6次，在室溫靜置5min
4.加在4度冰箱放置的Buffer P3，輕輕混 ...

這個(gè)盒子我沒有用過，我做質(zhì)粒中提用的是OMEGA的盒子。不過，對比之下，你的這個(gè)盒子很麻煩，為什么過柱子后還需要自己異丙醇沉降？另外，我提gDNA是用無水乙醇沉降的，不知道質(zhì)粒為什么用異丙醇。
不過，好像并沒有幫到你，不好意思啊

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10樓2013-09-05 18:38:05

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另外，你應(yīng)該了解一下這個(gè)試劑盒里的所有試劑的作用，有助于找出原因。

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11樓2013-09-05 18:40:56

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2008101111

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這個(gè)試劑盒也太麻煩了，沒見過這么多步驟的，換其他家的試試，推薦OMEG

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12樓2013-09-06 09:33:11

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grape_vine

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10樓: Originally posted by ykluuniu at 2013-09-05 18:38:05
這個(gè)盒子我沒有用過，我做質(zhì)粒中提用的是OMEGA的盒子。不過，對比之下，你的這個(gè)盒子很麻煩，為什么過柱子后還需要自己異丙醇沉降？另外，我提gDNA是用無水乙醇沉降的，不知道質(zhì)粒為什么用異丙醇。
不過，好像并沒 ...

異丙醇和乙醇的效果差不多,但所用體積更小!

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13樓2013-09-06 09:52:34

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ivyvampire

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5樓: Originally posted by 風(fēng)吹我已散 at 2013-09-05 08:47:57
質(zhì)粒大小：8K左右；都是按試劑盒上的步驟�。�
1. 50ml過夜菌液離心5000rpm 10分鐘
2. 將沉淀重懸于4ml Buffer P1
3. 加4ml Buffer P2，上下顛倒4~6次，在室溫靜置5min
4.加在4度冰箱放置的Buffer P3，輕輕混 ...

你這是中抽吧，濃度居然這么低
試劑盒出問題了，我們之前用他家的膠回收，回收濃度也是突然從60ng/ul降到10ng/ul，害的我要多切一條帶才夠用

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14樓2013-09-10 14:39:51

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