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寂寞強(qiáng)強(qiáng)銅蟲 (正式寫手)
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提質(zhì)粒遇到問題
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今天用試劑盒提取質(zhì)粒，結(jié)果上午提質(zhì)粒后用3ul樣品+1ulbuffer跑膠6組都能發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒，我們組的最清晰（第一張圖的marker左邊第二條帶），下午酶切（大概2-2.5h）后把載體的酶切產(chǎn)物（100ul體系+20ul 6*buffer）跑膠結(jié)果都沒有發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒的條帶。大家說說是怎么回事呢？難道是Buffer加多了，還是酶切出問題了？ 還有，昨天提質(zhì)粒的時候，一格marker一格質(zhì)粒，我們組跑膠時間比較長，質(zhì)粒那條帶在遷移過程中有一些不明顯的條帶在10000bp的地方有個模糊的條帶，這個可能是什么？怎么會有這個東西 |
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2樓2011-08-26 21:33:46
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3樓2011-08-26 21:54:16
wanhscn
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4樓2011-08-26 21:55:21
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7樓2011-08-26 23:26:07
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lstt09nk(金幣+5): 熱心的娃 2011-08-27 10:42:21
lstt09nk(金幣+5): 熱心的娃 2011-08-27 10:42:21
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3微升電泳條帶才那么窄那么暗，說明你的質(zhì)粒濃度低，酶切的時候是要加緩沖液和水的，如果質(zhì)粒加得少，就很容易被稀釋了。看你的圖片，膠孔應(yīng)該是小的，看你的膠，直覺應(yīng)該不是薄的，那么你的一個膠孔大概能上10微升，你酶切的時候用100微升的體系，那么要保證能看的到條帶，你切質(zhì)粒30微升比較保險，你是切多少微升的？酶切體系沒必要那么大，20微升體系就行了，過多了就把質(zhì)粒稀釋了，還浪費酶。 你的ladder很詭異，為什么在靠近膠孔的地方有一條帶？是不是ladder臟了導(dǎo)致跑的速度不均一？ 第二張圖，是不是前面幾個膠孔上的樣品沒有提取得到質(zhì)粒？看起來是有RNA的，說明細(xì)胞已經(jīng)破碎了，是不是手工提取的？第一張圖中沒有RNA，可以對比一下。至于那個模糊的帶，是有點像基因組的DNA，也像質(zhì)粒的復(fù)制中間體。 |
8樓2011-08-26 23:53:06
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【答案】應(yīng)助回帖
寂寞強(qiáng)強(qiáng)(金幣+1): 很感謝啊，那么熱心，回答的很詳細(xì) 2011-08-27 07:51:02
lstt09nk(BioEPI+1): 2011-08-27 10:43:14
lstt09nk(BioEPI+1): 2011-08-27 10:43:14
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分析： 1.TOP10菌株中的質(zhì)粒應(yīng)是高拷貝，質(zhì)粒多。3ml菌液用于提取質(zhì)粒即可。過夜搖菌時間不要超過12小時為宜，不然菌株老化，影響質(zhì)粒提取。 2.最后一步加水洗脫，可加入50℃預(yù)熱的無菌水30ul洗過柱子，也可少量多次洗脫（如：15ul,洗脫兩次），這樣能提高洗脫效率。 3.成功提取的質(zhì)粒，電泳檢查常出現(xiàn)3條條帶，為質(zhì)粒的3種形態(tài)，環(huán)狀質(zhì)粒電泳速度最快，開環(huán)的最慢，屬于正�，F(xiàn)象。 4.個人質(zhì)粒酶切常用50ul體系,30ul質(zhì)粒，加上內(nèi)切酶和buffer,雙酶切時注意是否具有共用buffer，是否需要加入BSA，兩個酶最適酶切溫度是否均為37℃（有些酶最適30℃）。 5.100ul酶切體系太大，浪費試劑的同時，更影響下不的切膠回收，膠塊越大，切膠回收效率越低 6.當(dāng)質(zhì)�；駾NA濃度較低時，電泳時間不能太長，展開距離，離點樣孔最好不要超過2cm，否定常�？床坏侥康臈l帶。 個人認(rèn)為，問題出現(xiàn)在上游的質(zhì)粒提取部分，可重新?lián)u菌提取質(zhì)粒（注意操作）。 祝你成功！ |
9樓2011-08-27 00:25:11
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10樓2011-08-27 00:31:25
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