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liuwei78銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
提質(zhì)粒的問題
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下圖是我提的兩次質(zhì)粒。1、2泳道提的效果很差，不知道提出來的這個(gè)條帶是缺刻還是雙螺旋？3、4泳道條帶是明顯的，但是不清楚紅線圈內(nèi)的條帶是什么。希望大家?guī)臀医忉屜隆?br />
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T.Shen
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2樓2011-08-03 11:59:25
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6樓2011-08-03 14:15:54
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
dhd997(金幣+3): 歡迎多來交流 2011-08-09 07:18:19
liuwei78(金幣+1): 2011-09-08 16:25:53
dhd997(金幣+3): 歡迎多來交流 2011-08-09 07:18:19
liuwei78(金幣+1): 2011-09-08 16:25:53
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質(zhì)粒提出來三個(gè)條帶是對的啊，線性，超螺旋，環(huán)狀，三種構(gòu)像的質(zhì)粒在瓊脂糖電泳的前后順序是超螺旋>線形>開環(huán)，線形的質(zhì)粒在中間，而開環(huán)的質(zhì)粒在最后。 1 從細(xì)菌中大量提取的質(zhì)粒電泳時(shí)，不一定均出現(xiàn)三條帶，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)兩條，甚至一條(一般是超螺旋的質(zhì)粒)，這跟上樣量也有些關(guān)系。出現(xiàn)不同的結(jié)果都是由抽提質(zhì)粒時(shí)的操作手法造成的。如果嚴(yán)格按照操作步驟，超螺旋的質(zhì)粒會(huì)較多。 2 酶切將質(zhì)粒線性化以后，才可以用mark判斷大小。如果有三種構(gòu)像，可以用中間那條帶與mark比較判斷大小。 3 酶切后線性化條帶電泳時(shí)所處的位置就指示質(zhì)粒的大小 |
7樓2011-08-08 23:41:04
8樓2011-08-09 09:48:38
w2boluo
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【答案】應(yīng)助回帖
liuwei78(金幣+5): 2011-09-08 16:25:34
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樓主這個(gè)圖可以說提得慘不忍睹。1，2的產(chǎn)量太低，帶型位置也更接近于缺刻質(zhì)粒；3，4的雜質(zhì)含量太高。所謂的質(zhì)粒3條帶應(yīng)該都在超螺旋質(zhì)粒的上方，下方出現(xiàn)很淡的帶，按分子克隆的說法，屬于質(zhì)粒在強(qiáng)變性條件下處理過長，變成無規(guī)則卷曲構(gòu)象，電泳大小約為正常帶型的一半。這種情況多見于煮沸法，堿法提取質(zhì)粒在加入溶液II，也就是NaOH+SDS溶液后靜置時(shí)間過長也會(huì)出現(xiàn)，現(xiàn)在的試劑盒多采用減法，加入裂解液后溶液變澄清即可馬上加入中和液（溶液III），不必等待。但這種變形帶型對后續(xù)實(shí)驗(yàn)基本無影響，也可以完全不理它。 給樓主的建議：注意一下菌體的濃度以及和抽提液的比例，3，4這樣的泳道應(yīng)該記下所用的原始培養(yǎng)基的體積，下次提取的時(shí)候減半；電泳marker不要用DL2000，差的比較遠(yuǎn)。 |
9樓2011-08-09 10:38:31
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