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質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌野生菌中驗(yàn)證遇到的非常非常怪的問(wèn)題 已有1人參與
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如題,我將4個(gè)質(zhì)粒p3,p4,p5,p6轉(zhuǎn)化到大腸桿菌野生菌中,該菌已報(bào)道有野生質(zhì)粒,并對(duì)外源質(zhì)粒有排斥性.質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后挑出能在kan平板生長(zhǎng)的菌落,此時(shí)原菌不能在抗生素平板生長(zhǎng),說(shuō)明(1)抗生素未失活(2)原菌不具有kan抗性.接下來(lái)就是驗(yàn)證. (1)提質(zhì)粒,如圖1,p1,p2為原菌,p3-p6為重組菌.可是提出質(zhì)粒圖譜一樣的,p3,p4 是7K多,p5,p6是8K多.但是沒(méi)什么差別.將這6個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證,第一次酶切完什么都沒(méi)有了,第二次切出彌散的條帶,6個(gè)都一樣. (2)PCR驗(yàn)證 如圖2,第一個(gè)M前面6個(gè),是用重組質(zhì)粒上的抗性引物PCR,中間的4個(gè)和后面的4個(gè)分別是用重組質(zhì)粒上攜帶的目的基因引物PCR,可是原菌仍然有條帶.只是稍稍弱一些. (3)將PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切 也許是我這三對(duì)PCR引物特異性不好,所以可能有假陽(yáng)性存在,但是原菌和重組菌的PCR片段應(yīng)該不一樣,而且第一個(gè)是抗性片段,原菌是沒(méi)有抗性的,所以應(yīng)該是不一樣的,可是我用三個(gè)PCR片段中的單酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切后,見(jiàn)圖3,也悲劇了,還是一樣一樣的,而且酶切片段與理論上是相符的.哎,這到底是個(gè)什么菌啊,豈能如此強(qiáng)大.現(xiàn)在唯一確定的就是重組質(zhì)粒具有抗性了.請(qǐng)問(wèn)各位高手們,這種情況下我該怎么去驗(yàn)證和解釋? 圖1 圖2 圖3 |
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