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[交流]
質(zhì)粒轉化到大腸桿菌野生菌中驗證遇到的非常非常怪的問題 已有1人參與
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如題,我將4個質(zhì)粒p3,p4,p5,p6轉化到大腸桿菌野生菌中,該菌已報道有野生質(zhì)粒,并對外源質(zhì)粒有排斥性.質(zhì)粒轉化后挑出能在kan平板生長的菌落,此時原菌不能在抗生素平板生長,說明(1)抗生素未失活(2)原菌不具有kan抗性.接下來就是驗證. (1)提質(zhì)粒,如圖1,p1,p2為原菌,p3-p6為重組菌.可是提出質(zhì)粒圖譜一樣的,p3,p4 是7K多,p5,p6是8K多.但是沒什么差別.將這6個質(zhì)粒進行雙酶切驗證,第一次酶切完什么都沒有了,第二次切出彌散的條帶,6個都一樣. (2)PCR驗證 如圖2,第一個M前面6個,是用重組質(zhì)粒上的抗性引物PCR,中間的4個和后面的4個分別是用重組質(zhì)粒上攜帶的目的基因引物PCR,可是原菌仍然有條帶.只是稍稍弱一些. (3)將PCR產(chǎn)物進行酶切 也許是我這三對PCR引物特異性不好,所以可能有假陽性存在,但是原菌和重組菌的PCR片段應該不一樣,而且第一個是抗性片段,原菌是沒有抗性的,所以應該是不一樣的,可是我用三個PCR片段中的單酶切位點進行酶切后,見圖3,也悲劇了,還是一樣一樣的,而且酶切片段與理論上是相符的.哎,這到底是個什么菌啊,豈能如此強大.現(xiàn)在唯一確定的就是重組質(zhì)粒具有抗性了.請問各位高手們,這種情況下我該怎么去驗證和解釋? 圖1 圖2 圖3 |
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