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chui2004鐵桿木蟲 (正式寫手)
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[交流]
【求助/交流】大腸桿菌轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，出來的不是我要的了，怎么回事？ 已有8人參與
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最近在做質(zhì)粒構(gòu)建的工作，當(dāng)沒有完成最終構(gòu)建之前，質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌都很正常，而且很容易轉(zhuǎn)化成功，但是將質(zhì)粒構(gòu)建成功后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌變得非常困難，而且DH5a轉(zhuǎn)不進去;JM109，TOP10轉(zhuǎn)入后，跑電泳比我的目的質(zhì)粒小了，做雙酶切檢定，不是我要的質(zhì)粒載體，這是怎么回事呢？ 我做的是一個重組酶的載體，原始載體是pBV220，將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，在30°培養(yǎng)時，重組酶是否表達？原因是我在沒誘導(dǎo)之前，質(zhì)粒DNA已經(jīng)發(fā)生了部分的重組。 |
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zhaohq1209
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我將構(gòu)建好的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入從某個公司買的E.clio DH5a感受態(tài)，這個感受態(tài)是個突變株，我這個質(zhì)粒能轉(zhuǎn)化進去（提的質(zhì)粒測序，序列正確），但是轉(zhuǎn)正常的DH5a就轉(zhuǎn)不進去。 當(dāng)轉(zhuǎn)BL21時，質(zhì)粒能進去，在30°培養(yǎng)時，出來了比目的質(zhì)粒小的質(zhì)粒，我將提出來的質(zhì)粒做雙酶切，與我的目的質(zhì)粒的雙酶切電泳圖是一致的，因此，我是否可以判斷我的質(zhì)粒（原始質(zhì)粒是pBV220)在30°時，重組酶已經(jīng)表達了。 我現(xiàn)在很郁悶�。〔恢涝撛趺赐伦隽恕� |
4樓2011-04-13 08:23:50
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1：你說你轉(zhuǎn)正常的DH5a轉(zhuǎn)不進去，轉(zhuǎn)從公司買來的DH5a突變株就可以，這其實很正常，因為突變株有可能會導(dǎo)致你的質(zhì)粒掛掉。。。 2：你轉(zhuǎn)BL21時，雖說質(zhì)粒比目的質(zhì)粒小，很正常，因為質(zhì)粒在細菌中的狀態(tài)是不斷變化的，唯一驗證的方法就是酶切，既然你現(xiàn)在酶切驗證沒什么問題，說明你的重組載體是沒有任何問題的，至于你說的重組酶是否已經(jīng)表達有何證據(jù)？基因連接到載體上面就一定會表達嗎？即便你這個載體也是表達的載體，不知道你要表達這個重組酶是否需要添加誘導(dǎo)劑呢？ |
5樓2011-04-13 10:14:08
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7樓2011-04-13 11:38:29
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我不知道能不能解決你的問題。 1 本來重組質(zhì)粒就是難轉(zhuǎn)化。還有的轉(zhuǎn)化進去了結(jié)果拷貝數(shù)低。建議你先在TOP10中擴增質(zhì)粒，然后再化轉(zhuǎn)或者電轉(zhuǎn)質(zhì)粒，會比較好。 2 質(zhì)粒是否與marker對應(yīng)關(guān)系，記得使用的marker是質(zhì)粒的marker，比如TAKARA的supercoil是可以對應(yīng)的。如果你使用線性的marker當(dāng)然不同。 而且，質(zhì)粒有線性結(jié)構(gòu)，環(huán)狀結(jié)構(gòu)，超螺旋結(jié)構(gòu)，所以會有大小的不同三條帶。 3 如果酶切質(zhì)粒后的基因大小不對應(yīng)，建議切膠回收送去測序看看確定下。 |
10樓2011-04-15 09:43:14
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