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chui2004鐵桿木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[交流]
【求助/交流】大腸桿菌轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，出來(lái)的不是我要的了，怎么回事？ 已有8人參與
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最近在做質(zhì)粒構(gòu)建的工作，當(dāng)沒(méi)有完成最終構(gòu)建之前，質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌都很正常，而且很容易轉(zhuǎn)化成功，但是將質(zhì)粒構(gòu)建成功后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌變得非常困難，而且DH5a轉(zhuǎn)不進(jìn)去;JM109，TOP10轉(zhuǎn)入后，跑電泳比我的目的質(zhì)粒小了，做雙酶切檢定，不是我要的質(zhì)粒載體，這是怎么回事呢？ 我做的是一個(gè)重組酶的載體，原始載體是pBV220，將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，在30°培養(yǎng)時(shí)，重組酶是否表達(dá)？原因是我在沒(méi)誘導(dǎo)之前，質(zhì)粒DNA已經(jīng)發(fā)生了部分的重組。 |
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我將構(gòu)建好的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入從某個(gè)公司買的E.clio DH5a感受態(tài)，這個(gè)感受態(tài)是個(gè)突變株，我這個(gè)質(zhì)粒能轉(zhuǎn)化進(jìn)去（提的質(zhì)粒測(cè)序，序列正確），但是轉(zhuǎn)正常的DH5a就轉(zhuǎn)不進(jìn)去。 當(dāng)轉(zhuǎn)BL21時(shí)，質(zhì)粒能進(jìn)去，在30°培養(yǎng)時(shí)，出來(lái)了比目的質(zhì)粒小的質(zhì)粒，我將提出來(lái)的質(zhì)粒做雙酶切，與我的目的質(zhì)粒的雙酶切電泳圖是一致的，因此，我是否可以判斷我的質(zhì)粒（原始質(zhì)粒是pBV220)在30°時(shí)，重組酶已經(jīng)表達(dá)了。 我現(xiàn)在很郁悶啊！不知道該怎么往下做了。 |
4樓2011-04-13 08:23:50
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1：你說(shuō)你轉(zhuǎn)正常的DH5a轉(zhuǎn)不進(jìn)去，轉(zhuǎn)從公司買來(lái)的DH5a突變株就可以，這其實(shí)很正常，因?yàn)橥蛔冎暧锌赡軙?huì)導(dǎo)致你的質(zhì)粒掛掉。。。 2：你轉(zhuǎn)BL21時(shí)，雖說(shuō)質(zhì)粒比目的質(zhì)粒小，很正常，因?yàn)橘|(zhì)粒在細(xì)菌中的狀態(tài)是不斷變化的，唯一驗(yàn)證的方法就是酶切，既然你現(xiàn)在酶切驗(yàn)證沒(méi)什么問(wèn)題，說(shuō)明你的重組載體是沒(méi)有任何問(wèn)題的，至于你說(shuō)的重組酶是否已經(jīng)表達(dá)有何證據(jù)？基因連接到載體上面就一定會(huì)表達(dá)嗎？即便你這個(gè)載體也是表達(dá)的載體，不知道你要表達(dá)這個(gè)重組酶是否需要添加誘導(dǎo)劑呢？ |
5樓2011-04-13 10:14:08
chui2004
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7樓2011-04-13 11:38:29
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8樓2011-04-13 11:41:40
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9樓2011-04-15 08:50:20
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我不知道能不能解決你的問(wèn)題。 1 本來(lái)重組質(zhì)粒就是難轉(zhuǎn)化。還有的轉(zhuǎn)化進(jìn)去了結(jié)果拷貝數(shù)低。建議你先在TOP10中擴(kuò)增質(zhì)粒，然后再化轉(zhuǎn)或者電轉(zhuǎn)質(zhì)粒，會(huì)比較好。 2 質(zhì)粒是否與marker對(duì)應(yīng)關(guān)系，記得使用的marker是質(zhì)粒的marker，比如TAKARA的supercoil是可以對(duì)應(yīng)的。如果你使用線性的marker當(dāng)然不同。 而且，質(zhì)粒有線性結(jié)構(gòu)，環(huán)狀結(jié)構(gòu)，超螺旋結(jié)構(gòu)，所以會(huì)有大小的不同三條帶。 3 如果酶切質(zhì)粒后的基因大小不對(duì)應(yīng)，建議切膠回收送去測(cè)序看看確定下。 |
10樓2011-04-15 09:43:14
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