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寂寞強強銅蟲 (正式寫手)
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[求助]
提質粒遇到問題
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今天用試劑盒提取質粒，結果上午提質粒后用3ul樣品+1ulbuffer跑膠6組都能發(fā)現(xiàn)質粒，我們組的最清晰（第一張圖的marker左邊第二條帶），下午酶切（大概2-2.5h）后把載體的酶切產(chǎn)物（100ul體系+20ul 6*buffer）跑膠結果都沒有發(fā)現(xiàn)質粒的條帶。大家說說是怎么回事呢？難道是Buffer加多了，還是酶切出問題了？ 還有，昨天提質粒的時候，一格marker一格質粒，我們組跑膠時間比較長，質粒那條帶在遷移過程中有一些不明顯的條帶在10000bp的地方有個模糊的條帶，這個可能是什么？怎么會有這個東西 |
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【答案】應助回帖
寂寞強強(金幣+1): 很感謝啊，那么熱心，回答的很詳細 2011-08-27 07:51:02
lstt09nk(BioEPI+1): 2011-08-27 10:43:14
lstt09nk(BioEPI+1): 2011-08-27 10:43:14
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分析： 1.TOP10菌株中的質粒應是高拷貝，質粒多。3ml菌液用于提取質粒即可。過夜搖菌時間不要超過12小時為宜，不然菌株老化，影響質粒提取。 2.最后一步加水洗脫，可加入50℃預熱的無菌水30ul洗過柱子，也可少量多次洗脫（如：15ul,洗脫兩次），這樣能提高洗脫效率。 3.成功提取的質粒，電泳檢查常出現(xiàn)3條條帶，為質粒的3種形態(tài)，環(huán)狀質粒電泳速度最快，開環(huán)的最慢，屬于正常現(xiàn)象。 4.個人質粒酶切常用50ul體系,30ul質粒，加上內切酶和buffer,雙酶切時注意是否具有共用buffer，是否需要加入BSA，兩個酶最適酶切溫度是否均為37℃（有些酶最適30℃）。 5.100ul酶切體系太大，浪費試劑的同時，更影響下不的切膠回收，膠塊越大，切膠回收效率越低 6.當質�；駾NA濃度較低時，電泳時間不能太長，展開距離，離點樣孔最好不要超過2cm，否定常�？床坏侥康臈l帶。 個人認為，問題出現(xiàn)在上游的質粒提取部分，可重新?lián)u菌提取質粒（注意操作）。 祝你成功！ |
9樓2011-08-27 00:25:11
cexoihtydx
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2樓2011-08-26 21:33:46
wanhscn
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4樓2011-08-26 21:55:21
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