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[求助]
Sac1和Xho1的雙酶切連接
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我在做Sac1和Xho1的雙酶切連接，分別用這兩個酶對表達載體和T載體進行雙酶切3h（NEB的酶 ），T載體上我還加了保護堿基，然后分別切膠回收表達載體的大片段和T載體上的目的片段（兩個片段都很亮，大小也合適，大片段約16k，目的片段1100bp）,大片段濃度是150納克/微升，小片段是33納克/微升，然后做連接（連接是用的promega的T4連接酶，16度16小時 22度3小時 4度過夜都試過），共20微升體系（2微升連接酶，2微升10×連接buffer， 共做了三個比例即大片段與目的片段兩者的摩爾比是1:6 1:10 和1:15），再進行熱擊轉(zhuǎn)化涂皿，分別做了陽性對照即空載體（長很多單菌落）和陰性對照（無單菌落）可以證明感受態(tài)及轉(zhuǎn)化過程沒問題，雙酶切也成功�？蔀槭裁次业倪B接反應卻一個單菌落也長不出來呢（抗性和濃度也沒問題），哪位高人幫幫忙？？？最近快煩死了。。。。。 還有幾個疑問： 1 難道是我的載體和片段的濃度不高還是太高，濃度是多少才合適呢？ 2 不好連接是不是因為我的載體太大的原因 3 難道要我分步酶切嗎？ 4 求幫助啊啊啊。。。 |
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yudaoqian88
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【答案】應助回帖
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33ggdf: 金幣+6, ★★★很有幫助 2013-09-14 10:06:35
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33ggdf: 金幣+6, ★★★很有幫助 2013-09-14 10:06:35
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我之前也遇到同樣的問題，而且要比樓主的還要嚴重。PCR擴增三個片段，TA克隆連了三個月才有陽性克隆，后來同樣用這樣的方法分步酶切、回收、連接，構(gòu)建表達載體。多次都沒有成功。也就找各種原因，回收濃度，連接比例，時間，溫度，酶切是否完全都感覺是問題的所在，一直重復也沒有結(jié)果，現(xiàn)在我可以很有理由的告訴你，是膠回收過程影響了連接反應（我們用QIAGEN的盒子，也不行），采用一步法連接就好了： 1：如果你的目標載體的抗性和T載體不同，就好辦了。抽提重組質(zhì)粒和目標載體質(zhì)粒，按照3:1-8:1的比例T質(zhì)粒和目標載體，配制酶切體系，然后酒精沉淀回收，直接作為混合物配制連接體系。 2：如果抗性一樣，同樣參照上述方法，只是要大量降低兩種質(zhì)粒的用量�？梢苑謩e將重組質(zhì)粒和載體分別配制體系進行酶切，然后混合，酒精沉淀，其他同上。 3大量挑取克隆，采用菌液PCR法或根據(jù)重組質(zhì)粒大小不同，采用酶切法鑒定重組子（質(zhì)粒小量粗提，自己配制試劑，很方便），1號菌斑少，陽性率高。2號抗性一致，需要根據(jù)3所述情況分級篩選。 4PCR鑒定的陽性克隆，可再通過質(zhì)粒酶切檢測進一步鑒定。 具體方案可參考我的碩士論文，里面有相同的篩選策略<<亞洲棉種皮特異性啟動子的克隆及表達載體構(gòu)建>> 希望對你有所幫助，祝好！此外，我也是新手，大家相互學習哈！ |
4樓2013-09-13 23:54:43
yudaoqian88
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【答案】應助回帖
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33ggdf: 金幣+3 2013-09-14 10:05:59
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1 凝膠回收片段可能會影響后續(xù)連接實驗； 2 傳統(tǒng)構(gòu)建方法無法成功的情況下，可使用直接法，及酶切產(chǎn)物酒精沉淀法，可提高連接效率，但工作量較大； 3 使用in fusion技術，可以提高連接效率，減少工作量 |
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2013-09-14 00:04:55, 1.92 M
5樓2013-09-14 00:07:45
【答案】應助回帖
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gyesang: 回帖置頂 2013-09-26 15:07:47
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1. 分別用這兩個酶做下單酶切驗證，包括載體和片段，確定酶切位點沒有問題。 2. 如果確定酶切沒有問題，雙酶切回收后的產(chǎn)物用1—2ul 跑下電泳看下，片段是否回收。 3. 鑒于載體片段很大，因此可以再加大小片段的量，提高比例到1:100都沒問題（濃縮下片段）。另外換個酶連接，防止酶失效。 4. 在后期鑒定的時候最好在載體兩端找引物進行PCR鑒定，或者找載體上的酶切位點鑒定，防止多拷貝插入。 5. 建議加一個載體片段自連的陰性對照。 |
6樓2013-09-25 19:07:43
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2樓2013-09-13 16:22:32
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3樓2013-09-13 16:26:00
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