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[求助]
酶切連接 （難題一個接一個呀）
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| 我在做Sac1和Xho1的雙酶切連接（這兩個酶切位點應(yīng)該沒啥問題吧 ？），分別用這兩個酶對表達(dá)載體和T載體進(jìn)行雙酶切過夜（NEB的酶 標(biāo)注說過夜不會產(chǎn)生星活性），T載體上我還加了保護(hù)堿基，然后分別切膠回收表達(dá)載體的大片段和T載體上的目的片段（兩個片段都很亮，大小也合適，大片段約16k，目的片段1100bp）,大片段濃度是150納克/微升，小片段是33納克/微升，然后做連接（連接是用的NEB的普通連接酶，16度16小時），共20微升體系（1微升連接酶，連接酶我用的是新的;2微升10×連接buffer，也換過新的; 共做了三個比例即大片段與目的片段兩者的摩爾比是1:6 1:10 和1:15），再進(jìn)行熱擊轉(zhuǎn)化涂皿，分別做了陽性對照（很多單菌落）和陰性對照（無單菌落）可以證明感受態(tài)及轉(zhuǎn)化過程沒問題，雙酶切也成功�？蔀槭裁次业倪B接反應(yīng)卻一個單菌落也長不出來呢（抗性和濃度也沒問題），哪位高人幫幫忙？？？最近快煩死了。。。。。 |
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 核酸生物學(xué)實驗經(jīng)驗 |
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4樓2013-09-01 22:46:12
【答案】應(yīng)助回帖
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33ggdf: 金幣+2 2013-09-02 19:16:27
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gyesang: 回帖置頂 2013-09-04 21:51:51
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太巧了，我正好也在用這兩個酶做雙酶切連接。 前面有人提到的解決方法是對的：載體酶切處理后一定要脫磷處理，因為SacI和XhoI是同尾酶，產(chǎn)生相同的粘性末端！ 但是，這個說法不是解決樓主問題的首要方法，看樓主的描述是連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生不了任何單菌落，這問題就大了。 我的疑點，僅供參考： 1. 我很懷疑你的載體是不是有問題，可以分別用SacI和XhoI對載體進(jìn)行單酶切處理，然后加上不酶切的載體做對照，看看你的載體是否真的能被切開，如果不能被切開，說明有兩個可能，一是載體錯了，二是載體上酶切位點不好用了； 2. 你說你做了陽性對照，陽性對照是什么呢？有沒有做這樣一個必要的對照：用空載體同步轉(zhuǎn)化，它在平皿上能正常生長。如果不能，也說明你的載體是錯誤的，這能很好解釋為什么你的連接轉(zhuǎn)化產(chǎn)物什么都不長； 3. 再有一點是，前面大家有人提到SacI和XhoI是同尾酶，如果你的載體沒有脫磷處理，理論上上會產(chǎn)生大量的自連，那么在你的轉(zhuǎn)化涂板的平皿上應(yīng)該看到很多菌落才對。你看不到，也說明你的載體很可能是錯誤的； 4. 抗性問題，樓主自己已經(jīng)注意了，我就不多說了。 祝好! |
8樓2013-09-02 17:20:33
cr507
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3樓2013-09-01 21:22:30
11樓2013-09-04 15:20:30
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kx444555: 金幣+5, 鼓勵交流 2013-09-04 16:35:37
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載體自連的話那應(yīng)該會長菌才對，但是樓主沒長啊。 我最近也做轉(zhuǎn)化，13k的載體和1400bp的片段，試了很多連接方法，也做了各種對照，takara的、neb的酶都試過了，連過夜，快連，還用重組酶，也總是沒有菌。 現(xiàn)在做了3個星期了，上一批的終于長了3個出來了，今天做菌p。希望能有陽性。 說了這么多，就是多做，如果其他沒問題，總會做出來的。另外實驗的一些小細(xì)節(jié)要多注意，因為這么大的載體做轉(zhuǎn)化，效率本來就很低，要是細(xì)節(jié)不注意的話，就很難長出來了。 |
12樓2013-09-04 16:00:48
suhsia
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2樓2013-08-31 16:23:24
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5樓2013-09-02 10:13:31
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轉(zhuǎn)化后沒有克隆長出，說明載體已經(jīng)全切開，轉(zhuǎn)化的陰性對照也沒問題話，可能是連接的問題，或者片段沒切好 以下幾點注意一下 1、NEB SacI、XhoI的建議buffer：Digest in CutSmart™ Buffer at 37°C. 2、時間的話NEB2-3h即可，時間太長不好，回切亂 3、片段是否設(shè)有保護(hù)堿基？ 4、可以再少加點載體，多加些片段進(jìn)去 再試一次，應(yīng)該能成功 |
9樓2013-09-02 19:13:47
10樓2013-09-02 19:19:06
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