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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 載體和酶切片段連接的問題
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wanghx_2012銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
載體和酶切片段連接的問題
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| 各位朋友,我現在在做重組質粒,用的是PHT304,想要在接頭區(qū)連接一個Cry3a的啟動子,現在我在啟動子的上下油分別加了Pst1和Xba1的酶切位點.我用雙酶切了T載體和304之后割膠回收了對應大小的片段,然后T4連接過夜轉化DH5a,挑抗性平板上長的單菌落做PCR時可以看到微弱的1000bp的條帶但是提質粒提出來的DNA遠大于重組質粒理論大小.酶切的時候也看不到目標條帶.我懷疑是不是有這樣的情況:我的啟動子自我連接了,然后這個連接體被接到了切開的304上.或則各位朋友有沒有什么好的建議.多謝!~ |
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2樓2012-08-22 11:56:37
sd3824289
木蟲 (正式寫手)
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3樓2012-08-24 10:20:08
mgangle
鐵桿木蟲 (著名寫手)
樂樂家族-----樂顛顛
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【答案】應助回帖
★ ★
wanghx_2012: 金幣+2, ★有幫助 2012-08-24 20:52:44
wanghx_2012: 金幣+2, ★有幫助 2012-08-24 20:52:44
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1.PCR擴增有弱條帶，但是酶切卻沒有，原因很可能是沒有連接到304載體，因為菌落PCR有時候也會出現假陽性，我們可以簡單理解為目的片段只是附著在菌落表面，所以PCR擴增是可以的，但是一旦搖成菌液再PCR檢測，可能連弱帶也沒有了，樓主實在不放心，簡單的方法是送去測序就知道有沒有連接上了！ 2.質粒與預測大小不一致，質粒正常提取一般會有螺旋，環(huán)狀等結構，質粒條帶的位置變化和這些結構也有一定關系，不能完全說明什么問題！ 所以最簡單的方法送去測序，一般一個反應也就25元左右，與酶切花費差不多。 |
4樓2012-08-24 16:25:34
wanghx_2012
銀蟲 (小有名氣)
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- 專業(yè): 蛋白質組學
5樓2012-08-24 20:52:04
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6樓2012-08-25 23:09:23
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