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friya0910新蟲 (正式寫手)
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[求助]
酶切的相關(guān)問題
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| 本人做蛋白的體外表達(dá)，現(xiàn)在已把目的片段連接到T載體測序（測序中），上、下游引物分別含有NcoI和BamHI酶切位點(diǎn)，可是突然發(fā)現(xiàn)我的T載體在TA克隆位點(diǎn)附近（不超過10個(gè)堿基）也有BamHI酶切位點(diǎn)，那我后續(xù)要用這兩個(gè)酶雙酶切T載體獲得目的基因的話，載體上的BamHI酶切位點(diǎn)對我后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響大不大啊？懇請高人指點(diǎn)一下！ |
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dhd997(金幣+3): good 2011-07-05 19:16:53
amisking: 2011-07-05 20:04:13
dhd997(金幣+3): good 2011-07-05 19:16:53
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BamHI雖然說活力比較高，但是也不排除可能有失效或者操作不當(dāng)造成酶切不完全，只能切去其中一個(gè)位點(diǎn)的情況，因?yàn)檫@兩個(gè)位點(diǎn)相隔很近，跑膠的時(shí)候是看不出10個(gè)堿基的差別的，這樣就可能造成回收的外源片段中有一部分還帶有幾個(gè)載體上的堿基。 我建議你設(shè)計(jì)引物的時(shí)候不要選用載體上存在的酶切位點(diǎn)，消除這個(gè)隱患。 |
2樓2011-07-05 18:57:15
friya0910
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3樓2011-07-05 19:18:46
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amisking(EPI+1): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2011-07-05 20:04:19
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不過話說回來，你為什么要先TA克隆呢？如果PCR出來之后直接將表達(dá)載體和外源片段雙酶切，然后連接，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽性單克隆培養(yǎng)提質(zhì)粒，這時(shí)候再測序就省事了，也不用擔(dān)心你載體上的BamHI酶切位點(diǎn)的干擾了，這樣一來整個(gè)含有你的片段的質(zhì)粒上就只有一個(gè)BamHI位點(diǎn)了，完全沒有隱患。 測序費(fèi)錢也不多，一個(gè)反應(yīng)就30塊錢而已，但可以測定超過600bp。 而且要雙向測通，因?yàn)闇y序是兩端不準(zhǔn)的，從單鏈得到的結(jié)果可能含有不準(zhǔn)的區(qū)間，需要從另一條單鏈測得的結(jié)果來拼接。 |
4樓2011-07-05 19:45:03
friya0910
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