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friya0910新蟲 (正式寫手)
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表達載體構(gòu)建的相關問題
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現(xiàn)在要構(gòu)建表達載體，有一些問題不是很明確，希望懂得的不吝賜教�。� 首先是雙酶切表達載體和帶有目的片段的T載體，一般都切多少時間��？我看有說切過夜的，也有切幾個小時的！切完以后大家都從哪些方面確定酶切完全不完全呢？ 其次是連接以后除了直接轉(zhuǎn)化以外，還有什么方法確定是否連接上了呢？ 本人新手一個，對于這方面不是很了解，希望各位幫幫忙！ |
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2樓2011-07-18 15:18:40
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3樓2011-07-18 15:27:39
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就是酶切時間4或5個小時啦，你的片段這么小哇。那你怎么做連接�。� 4樓2011-07-18 15:36:51
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5樓2011-07-18 15:44:30
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，你說你做用轉(zhuǎn)化液做轉(zhuǎn)化那幾句我沒看懂。6樓2011-07-18 17:03:37
【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金幣+5, EPI+1): Good!金屬浴沒聽說過，孤陋寡聞了……連接時我們一般放15度培養(yǎng)箱。 2011-07-20 16:13:11
friya0910(金幣+5): 2011-07-20 17:59:26
西瓜(金幣+5, EPI+1): Good!金屬浴沒聽說過，孤陋寡聞了……連接時我們一般放15度培養(yǎng)箱。 2011-07-20 16:13:11
friya0910(金幣+5): 2011-07-20 17:59:26
| 雙酶切37度水浴2——3個小時，之后瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶，若條帶正確則切膠回收，此時回收的為帶有兩個酶切位點的目的片段。該目的片段與已經(jīng)帶有該酶切位點的載體進行連接，若用T4連接酶，則需16度金屬浴過夜連接，之后進行轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)皿過夜培養(yǎng)，挑取3個左右生長良好、單個的菌落于5毫升左右的培養(yǎng)液中37度搖床培養(yǎng)6個小時，進行PCR鑒定是否成功，若電泳觀察條帶正確則抽質(zhì)粒，即為連到載體且含有酶切位點的質(zhì)粒，也可再次進行雙酶切鑒定。 |
7樓2011-07-20 14:04:28
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【答案】應助回帖
★ ★ ★
西瓜(金幣+3): 鼓勵應助 2011-07-20 16:13:23
friya0910(金幣+1): 2011-07-20 17:59:31
西瓜(金幣+3): 鼓勵應助 2011-07-20 16:13:23
friya0910(金幣+1): 2011-07-20 17:59:31
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看一下這兩個帖子吧http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=2311683 http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=3069329 |
8樓2011-07-20 14:40:29
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9樓2011-07-20 21:12:08
★ ★
西瓜(金幣+2): 鼓勵反饋哦 2011-07-21 11:23:33
西瓜(金幣+2): 鼓勵反饋哦 2011-07-21 11:23:33
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金屬浴：采用微電腦控制和半導體制冷技術制造的一款恒溫金屬浴產(chǎn)品，儀器可配置多種模塊，可廣泛應用于樣品的保存、各種酶的保存和反應、核酸和蛋白質(zhì)的變性處理、PCR 反應、電泳的預變性和血清凝固等。 性能特點： ★微電腦數(shù)顯控制溫度. ★采用先進的熱電膜加熱技術. ★同時顯示設置溫度和即時溫度. ★采用金屬模塊，可使樣品免受污染. ★金屬模塊可方便更換，便于清潔、消毒和適用各種試管. ★內(nèi)置超溫保護裝置，使用更可靠. ★溫度偏差校準。 這是在說明書上寫的，具體的我也不是太清楚，我們實驗室在進行目的基因連接到載體上時都是在金屬浴16度過夜連接的。 |
10樓2011-07-21 10:34:11
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