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friya0910新蟲 (正式寫手)
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[求助]
表達載體構(gòu)建的相關(guān)問題
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現(xiàn)在要構(gòu)建表達載體，有一些問題不是很明確，希望懂得的不吝賜教��！ 首先是雙酶切表達載體和帶有目的片段的T載體，一般都切多少時間��？我看有說切過夜的，也有切幾個小時的！切完以后大家都從哪些方面確定酶切完全不完全呢？ 其次是連接以后除了直接轉(zhuǎn)化以外，還有什么方法確定是否連接上了呢？ 本人新手一個，對于這方面不是很了解，希望各位幫幫忙！ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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西瓜(金幣+5, EPI+1): Good!金屬浴沒聽說過，孤陋寡聞了……連接時我們一般放15度培養(yǎng)箱。 2011-07-20 16:13:11
friya0910(金幣+5): 2011-07-20 17:59:26
西瓜(金幣+5, EPI+1): Good!金屬浴沒聽說過，孤陋寡聞了……連接時我們一般放15度培養(yǎng)箱。 2011-07-20 16:13:11
friya0910(金幣+5): 2011-07-20 17:59:26
| 雙酶切37度水浴2——3個小時，之后瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶，若條帶正確則切膠回收，此時回收的為帶有兩個酶切位點的目的片段。該目的片段與已經(jīng)帶有該酶切位點的載體進行連接，若用T4連接酶，則需16度金屬浴過夜連接，之后進行轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)皿過夜培養(yǎng)，挑取3個左右生長良好、單個的菌落于5毫升左右的培養(yǎng)液中37度搖床培養(yǎng)6個小時，進行PCR鑒定是否成功，若電泳觀察條帶正確則抽質(zhì)粒，即為連到載體且含有酶切位點的質(zhì)粒，也可再次進行雙酶切鑒定。 |
7樓2011-07-20 14:04:28
青菜小蟲
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2樓2011-07-18 15:18:40
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3樓2011-07-18 15:27:39
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就是酶切時間4或5個小時啦，你的片段這么小哇。那你怎么做連接�。� 4樓2011-07-18 15:36:51
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