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friya0910新蟲 (正式寫手)
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表達(dá)載體構(gòu)建的相關(guān)問題
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現(xiàn)在要構(gòu)建表達(dá)載體，有一些問題不是很明確，希望懂得的不吝賜教�。� 首先是雙酶切表達(dá)載體和帶有目的片段的T載體，一般都切多少時(shí)間��？我看有說切過夜的，也有切幾個(gè)小時(shí)的！切完以后大家都從哪些方面確定酶切完全不完全呢？ 其次是連接以后除了直接轉(zhuǎn)化以外，還有什么方法確定是否連接上了呢？ 本人新手一個(gè)，對于這方面不是很了解，希望各位幫幫忙！ |
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2樓2011-07-18 15:18:40
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3樓2011-07-18 15:27:39
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就是酶切時(shí)間4或5個(gè)小時(shí)啦，你的片段這么小哇。那你怎么做連接��？ 4樓2011-07-18 15:36:51
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5樓2011-07-18 15:44:30
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，你說你做用轉(zhuǎn)化液做轉(zhuǎn)化那幾句我沒看懂。6樓2011-07-18 17:03:37
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金幣+5, EPI+1): Good!金屬浴沒聽說過，孤陋寡聞了……連接時(shí)我們一般放15度培養(yǎng)箱。 2011-07-20 16:13:11
friya0910(金幣+5): 2011-07-20 17:59:26
西瓜(金幣+5, EPI+1): Good!金屬浴沒聽說過，孤陋寡聞了……連接時(shí)我們一般放15度培養(yǎng)箱。 2011-07-20 16:13:11
friya0910(金幣+5): 2011-07-20 17:59:26
| 雙酶切37度水浴2——3個(gè)小時(shí)，之后瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶，若條帶正確則切膠回收，此時(shí)回收的為帶有兩個(gè)酶切位點(diǎn)的目的片段。該目的片段與已經(jīng)帶有該酶切位點(diǎn)的載體進(jìn)行連接，若用T4連接酶，則需16度金屬浴過夜連接，之后進(jìn)行轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)皿過夜培養(yǎng)，挑取3個(gè)左右生長良好、單個(gè)的菌落于5毫升左右的培養(yǎng)液中37度搖床培養(yǎng)6個(gè)小時(shí)，進(jìn)行PCR鑒定是否成功，若電泳觀察條帶正確則抽質(zhì)粒，即為連到載體且含有酶切位點(diǎn)的質(zhì)粒，也可再次進(jìn)行雙酶切鑒定。 |
7樓2011-07-20 14:04:28
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【答案】應(yīng)助回帖
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西瓜(金幣+3): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2011-07-20 16:13:23
friya0910(金幣+1): 2011-07-20 17:59:31
西瓜(金幣+3): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2011-07-20 16:13:23
friya0910(金幣+1): 2011-07-20 17:59:31
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看一下這兩個(gè)帖子吧http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=2311683 http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=3069329 |
8樓2011-07-20 14:40:29
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9樓2011-07-20 21:12:08
★ ★
西瓜(金幣+2): 鼓勵(lì)反饋哦 2011-07-21 11:23:33
西瓜(金幣+2): 鼓勵(lì)反饋哦 2011-07-21 11:23:33
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金屬浴：采用微電腦控制和半導(dǎo)體制冷技術(shù)制造的一款恒溫金屬浴產(chǎn)品，儀器可配置多種模塊，可廣泛應(yīng)用于樣品的保存、各種酶的保存和反應(yīng)、核酸和蛋白質(zhì)的變性處理、PCR 反應(yīng)、電泳的預(yù)變性和血清凝固等。 性能特點(diǎn)： ★微電腦數(shù)顯控制溫度. ★采用先進(jìn)的熱電膜加熱技術(shù). ★同時(shí)顯示設(shè)置溫度和即時(shí)溫度. ★采用金屬模塊，可使樣品免受污染. ★金屬模塊可方便更換，便于清潔、消毒和適用各種試管. ★內(nèi)置超溫保護(hù)裝置，使用更可靠. ★溫度偏差校準(zhǔn)。 這是在說明書上寫的，具體的我也不是太清楚，我們實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行目的基因連接到載體上時(shí)都是在金屬浴16度過夜連接的。 |
10樓2011-07-21 10:34:11
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