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friya0910新蟲 (正式寫手)
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[求助]
酶切的相關(guān)問題
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| 本人做蛋白的體外表達(dá)，現(xiàn)在已把目的片段連接到T載體測序（測序中），上、下游引物分別含有NcoI和BamHI酶切位點(diǎn)，可是突然發(fā)現(xiàn)我的T載體在TA克隆位點(diǎn)附近（不超過10個堿基）也有BamHI酶切位點(diǎn)，那我后續(xù)要用這兩個酶雙酶切T載體獲得目的基因的話，載體上的BamHI酶切位點(diǎn)對我后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響大不大��？懇請高人指點(diǎn)一下！ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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西瓜(金幣+3): 學(xué)習(xí)了！ 2011-07-05 19:59:52
amisking(EPI+1): 鼓勵應(yīng)助 2011-07-05 20:04:19
西瓜(金幣+3): 學(xué)習(xí)了！ 2011-07-05 19:59:52
amisking(EPI+1): 鼓勵應(yīng)助 2011-07-05 20:04:19
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不過話說回來，你為什么要先TA克隆呢？如果PCR出來之后直接將表達(dá)載體和外源片段雙酶切，然后連接，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽性單克隆培養(yǎng)提質(zhì)粒，這時候再測序就省事了，也不用擔(dān)心你載體上的BamHI酶切位點(diǎn)的干擾了，這樣一來整個含有你的片段的質(zhì)粒上就只有一個BamHI位點(diǎn)了，完全沒有隱患。 測序費(fèi)錢也不多，一個反應(yīng)就30塊錢而已，但可以測定超過600bp。 而且要雙向測通，因?yàn)闇y序是兩端不準(zhǔn)的，從單鏈得到的結(jié)果可能含有不準(zhǔn)的區(qū)間，需要從另一條單鏈測得的結(jié)果來拼接。 |
4樓2011-07-05 19:45:03
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6樓2011-07-05 21:57:12
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