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wanghx_2012銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
載體和酶切片段連接的問(wèn)題
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| 各位朋友,我現(xiàn)在在做重組質(zhì)粒,用的是PHT304,想要在接頭區(qū)連接一個(gè)Cry3a的啟動(dòng)子,現(xiàn)在我在啟動(dòng)子的上下油分別加了Pst1和Xba1的酶切位點(diǎn).我用雙酶切了T載體和304之后割膠回收了對(duì)應(yīng)大小的片段,然后T4連接過(guò)夜轉(zhuǎn)化DH5a,挑抗性平板上長(zhǎng)的單菌落做PCR時(shí)可以看到微弱的1000bp的條帶但是提質(zhì)粒提出來(lái)的DNA遠(yuǎn)大于重組質(zhì)粒理論大小.酶切的時(shí)候也看不到目標(biāo)條帶.我懷疑是不是有這樣的情況:我的啟動(dòng)子自我連接了,然后這個(gè)連接體被接到了切開(kāi)的304上.或則各位朋友有沒(méi)有什么好的建議.多謝!~ |
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sd3824289
木蟲 (正式寫手)
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3樓2012-08-24 10:20:08
2樓2012-08-22 11:56:37
mgangle
鐵桿木蟲 (著名寫手)
樂(lè)樂(lè)家族-----樂(lè)顛顛
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【答案】應(yīng)助回帖
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wanghx_2012: 金幣+2, ★有幫助 2012-08-24 20:52:44
wanghx_2012: 金幣+2, ★有幫助 2012-08-24 20:52:44
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1.PCR擴(kuò)增有弱條帶，但是酶切卻沒(méi)有，原因很可能是沒(méi)有連接到304載體，因?yàn)榫銹CR有時(shí)候也會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性，我們可以簡(jiǎn)單理解為目的片段只是附著在菌落表面，所以PCR擴(kuò)增是可以的，但是一旦搖成菌液再PCR檢測(cè)，可能連弱帶也沒(méi)有了，樓主實(shí)在不放心，簡(jiǎn)單的方法是送去測(cè)序就知道有沒(méi)有連接上了！ 2.質(zhì)粒與預(yù)測(cè)大小不一致，質(zhì)粒正常提取一般會(huì)有螺旋，環(huán)狀等結(jié)構(gòu)，質(zhì)粒條帶的位置變化和這些結(jié)構(gòu)也有一定關(guān)系，不能完全說(shuō)明什么問(wèn)題！ 所以最簡(jiǎn)單的方法送去測(cè)序，一般一個(gè)反應(yīng)也就25元左右，與酶切花費(fèi)差不多。 |
4樓2012-08-24 16:25:34
wanghx_2012
銀蟲 (小有名氣)
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5樓2012-08-24 20:52:04
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