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pET28a雙酶切后連接目的基因，什么也不長。。。
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1.pET28a提出來時分子量就很大，8kb左右，不知道為什么提出來的質(zhì)粒分子量就狠大，但雙酶切后在5.5kb左右。見電泳圖：左邊到右分為為：marker（三條亮帶分別為6000 3000 1000） 雙切后質(zhì)粒 未酶切的質(zhì)粒 雙切后的目的基因（1.5kb） 2.我用SacI和HindIII雙酶切，體系20ul,10*tango buffer 2ul,質(zhì)粒DNA 16ul,SacI 1ul,HindIII 1ul.切出來的條帶在5.5kb左右。目的基因是從T載體上切下來的，20ul體系和質(zhì)粒雙酶切一樣，就把質(zhì)粒DNA換成目的基因16ul.電泳顯示是切開了的。37度酶切6小時。 3.10ul的連接體系：目的基因7ul,載體1.5ul,10*buffer 1ul,T4連接酶 0.5ul.4度過夜連接，什么也不長，我還設置了對照組，感受態(tài)組：什么也不轉(zhuǎn)，長得很好，說明感受態(tài)沒問題。質(zhì)粒自連組：質(zhì)粒 2ul，ddH2O 6.5ul,10*buffer 1ul,T4連接酶 0.5ul.什么也不長。雙切后的線性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，5ul的線性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化100ul感受態(tài)，也什么都不長。。。 重復好幾次了都不長，快崩潰了。。。 101_0045.JPG |
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gyesang: 回帖置頂 2013-04-28 17:32:56
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我的連接做出來了，在此分享下，希望能幫到遇到同樣問題的同學 1.我的質(zhì)粒提出來大小不對，可能就是構(gòu)想不同的原因，雖然我前幾次提的都是這么大，但有一次我提出來的質(zhì)粒大小事對的，在5,6k左右。但之前分子量大的質(zhì)粒不影響后續(xù)試驗 2.我之前一直連接不上市因為我的片段濃度都太小了，雙酶切完跑膠時條帶也不是很亮，回收損失一部分就更少了，后來加大上樣量，DNA片段濃度提高了，就連上了，雖然就長了兩個菌落，但都是陽性的，呵呵，目前不知道為啥連接效率這么低，空質(zhì)粒轉(zhuǎn)感受態(tài)的效率很高，所以應該不會是感受態(tài)的問題。希望大俠們幫我分析下原因，接下來還要連第二個基因，不想連接效率還是這么低啊 無論怎樣，只要連上就好 |
16樓2013-03-07 15:57:07
cicelyzh
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你做了很多對照，但是轉(zhuǎn)化最關鍵的是需要做一個陽性對照和陰性對照。你把感受態(tài)什么都不轉(zhuǎn)，涂的是無抗性的板子吧，否則不能長得很好。這個并不能說明感受態(tài)沒問題，只能說明感受態(tài)細胞復蘇得不錯。是否具備感受性需要用感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)一個抗性相同的質(zhì)粒，能轉(zhuǎn)進去才說明感受態(tài)好用，這是我提到的陽性對照。陰性對照應該是感受態(tài)什么都不轉(zhuǎn)涂抗性板，說明感受態(tài)細胞沒有污染，抗性平板篩選壓力足夠。 我有些不明白你說的質(zhì)粒自連是什么。質(zhì)�？隙ǹ梢赞D(zhuǎn)進去的，即使加了連接酶什么的，并不影響后面的轉(zhuǎn)化。做這個對照的意義是什么呢？ 對于線性載體，有人做這個對照，一般是把雙酶切的線性載體自連后轉(zhuǎn)化。如果出現(xiàn)很多克隆，說明酶切不完全。 |
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witeness3樓2013-03-02 13:20:24
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我建議你對DNA進行定量。 一般來說，設計一個連接反應，載體量最少需要50-100ng，而外源片段的分子數(shù)是載體分子數(shù)的3-10倍（具體質(zhì)量取決于你的載體或外源片段的大小，你可以自己換算）。連接體系為10ul，轉(zhuǎn)化時用一半（5ul）轉(zhuǎn)化50ul感受態(tài)細胞（最好用購買的感受態(tài)細胞，感受態(tài)的效率有保證），留下另一半備用。 最好設置各種對照，以方便分析失敗的原因，包括空載體連接對照等。 |
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9樓2013-03-02 22:47:57
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witeness(gyesang代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵回帖應助！ 2013-04-28 17:32:29
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如果是自己制備的感受態(tài)，每次新做一批都要驗證一下活性的。此外，酶切及回收的片段做連接最好定量，這樣可以保證反應的效率。 通過看你的一系列對照，我覺得你最好看看是不是T4連接酶的問題，試試把載體做單酶切的片段自連后轉(zhuǎn)化，應該有很多克隆才對。 關于質(zhì)粒的構(gòu)象，當然超螺旋是最好的，一般用盒子提的話主要是這種構(gòu)象的。開環(huán)的也不是不行，就是分子的一條鏈上有缺口，你雙酶切出來的片段應該可以用的。如果你每次提都是這樣的情況確實有些問題。你用盒子提其它質(zhì)粒的時候有同樣的問題嗎？ |
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